细胞培养中常见的问题解答

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细胞培养是生命科学实验中的基础实验，在细胞生长过程中，很多因素都会造成细胞生长不良。下面简单归纳一下细胞生长不良的原因及对应的解决方案。 

常见问题一：为什么细胞解冻后缺少活力，活细胞占比较低？

这种现象可能主要由以下几种原因所导致：

1.培养物冻存液等质量欠缺。

解决方案：

a.确保用来制备储存物（冻存液）的起始培养物需要保证其健康、无微生物污染、处于生长对数期后期状态。

b.收获细胞时需要小心翼翼，避免细胞损伤。 

2.储存物冻存方法不当

解决方案：

a.在液氮冷冻细胞时，确保细胞、培养基和其他试剂的浓度，以及冻存实验步骤依照供应商的建议。一般来说，冻存应该缓慢，大约1-3° C/min以减少冰晶形成。

b.使用电子可编程或机械冷冻装置以确保一致的、适当速率的冷冻。

c.选择最合适的细胞冷冻保护剂。如果使用甘油，不要将其存储在光照下，因为曝光会使甘油转化为有对细胞毒性的物质。

3.储存物保存不当 

解决方案：

a.储存物应时刻保持在-130℃，理想情况是置于液氮中，以确保较大的细胞活性。

b.如果将细胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到冻存管内，解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在液氮上方的气相环境中。 

4.细胞解冻方法不当 

解决方案：

a.一般来说，细胞应该快速解冻、使用预热的培养基、尽快移除含有冷冻保护剂的培养基防止细胞活力下降。

b.确保小心操作细胞。不要涡旋或高速离心，因为低温保存后的特别容易受到损伤。

常见问题二：细胞进行解冻或传代后细胞的附着力偏低?

这种情况主要是因为湿度过低致使培养容器上集聚静电所致。

可以通过适当增加房间湿度，使用防静电装置或者用消毒过的湿毛巾擦拭培养容器外侧，来减低静电产生。另外试剂混合不均匀，培养瓶转速等因素也可导致此现象发生。所以在进行细胞培养时，要确保细胞和所有试剂的溶液混合充分。在使用振荡培养箱进行细胞培养时，注意设置适宜的转速。

常见问题三：为什么细胞生长速度缓慢？

细胞生长过慢有很多原因，其主要原因如下：

1.细胞的传代次数太多，所以获得一个新的、亚培养次数较少的细胞储存液很有必要。

2.未选择合适的细胞收获时机。

在使用新的细胞储存液的同时，也要把我好适宜的细胞收获时机，一般在对数生长期的后期是细胞收获时间当细胞达到100%融合后，由于生长过于拥挤，会逐渐进入缓慢生长阶段，此时，细胞的活跃度也会随之下降。

培养基、血清、缓冲液等质量差，或者配方不合理。培养基、血清等培养物质是细胞生长的主要营养来源，所以其质量直接会影响到细胞的生长状态。所以高质量的培养基及合理的试剂配方维持细胞的良好生长具有决定的作用。

3.CO2浓度与缓冲系统需求不匹配，导致pH控制不足。

一般来说，细胞培养液中缓冲液中NaHCO3的浓度与CO2浓度成正比例关系。缓冲液中NaHCO3 的浓度高，所需求的CO2浓度也较高；这样才能达到PH平衡。

4.微生物污染，尤其是支原体

及时检查污染，防止微生物污染，做好支原体、器皿、环境消毒、支原体清除等工作。

5.培养物光敏降解产生细胞毒性物质。

如果培养基长时间暴露于荧光将会导致光敏感培养基组分转化成细胞毒性自由基和H2O2，从而影响到细胞生长甚至细胞凋亡。所以平时要在暗处保存细胞核培养基，避免荧光暴露。

6.不精确的细胞计数方法将导致细胞生长不良

a.确保计数样本充分混合，避免局部细胞密度差异影响精确计数

b.再次检查使用血球计数板进行细胞计数的所有运算  

常见问题四：为什么细胞生长会不均匀？

1.细胞或培养基的混合不充分：在培养基中接入细胞后应当轻摇混匀，在进入振荡培养箱后，保证持续稳定的振幅频率，避免局部浓度差异。

2.在细胞培养过程中有时候会出现同一时期相同器皿之间细胞生长不平衡。

这种情况可能是由于培养箱内部的温度不均一所导致。注意做好以下两点：

a.避免将培养器皿叠放，因为底部的培养器皿最靠近金属架可能加热最快。

b.如果放在培养箱前部的培养器皿比后面的生长慢，要注意保持培养箱的门尽可能关严，并将前面的培养器皿移到后面。

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