台盼蓝染色细胞计数的实验步骤和方法

细胞计数是确定培养中铺板的细胞浓度、确定细胞活力和评估细胞分离程序结果的一个组成部分。建议在细胞分离之前进行初始细胞计数；然后可以将该数字与细胞分离后的细胞计数进行比较，以计算细胞恢复率。此外，当预期细胞活力可能会降低时，应进行活细胞计数，例如，在处理冷冻保存的细胞或离体操作的细胞时。

    可以使用台盼蓝或3% 乙酸和亚甲蓝进行细胞计数. 进行总有核细胞计数时，建议使用 3% 乙酸和亚-CH3蓝。乙酸溶解细胞膜，亚甲蓝染色暴露的细胞核。由于成熟的红细胞缺乏细胞核，因此在计数时被排除在外。或者，建议使用台盼蓝来计数活的哺乳动物细胞。台盼蓝穿透细胞膜，因此它进入细胞膜受损的细胞（死细胞）的细胞质，将它们染成蓝色。活细胞保持完整，可以通过排除蓝色染料的能力与死细胞区分开来。在这种情况下，人们将计算完整的活细胞。

   本文描述了如何使用 3% 乙酸和亚-CH3蓝进行总有核细胞计数，以及如何通过台盼蓝染料排除进行活细胞计数。

材料准备：

3% 乙酸和亚-CH3蓝（或台盼蓝

96 孔板（例如 Corning® 96 孔圆底微孔板，货号 #38018）或微量离心管（例如 Costar® 微量离心管，货号#38090）

血细胞计数器（血细胞计数板）和盖玻片

70% C2H6O

移液器（例如瑞宁移液器）

实验步骤和方法：

第一部分：样品制备

选项 1：用 3% 乙酸和亚-CH3蓝对总有核细胞计数进行细胞稀释

  使用磷酸盐缓冲盐水或无血清培养基对充分混合的单细胞悬浮液进行适当稀释。为了准确表示浓度，请使用至少 20 μL 的细胞悬浮液进行稀释。

示例：制备 10 倍稀释液

在微量离心管或 96 孔板的孔中加入 180 μL 的 3% 乙酸和亚-CH3蓝。混合细胞悬浮液，将 20 μL 添加到含有 3% 乙酸和亚-CH3蓝的试管或孔中。

选项 2：通过台盼蓝染料排除对活细胞计数进行细胞稀释

 确保要计数的细胞悬浮液*重新悬浮。在细胞沉降之前，将适量的细胞悬液 (20-200 μL) 放入离心管中。加入等体积的 0.4% 台盼蓝并轻轻混合。将混合物在室温 (15°C – 25°C) 下孵育 5 分钟。

第二部分：使用血细胞计数器进行细胞计数

   通过用 70% C2H6O清洁腔室表面来制备血细胞计数器。擦干。将盖玻片放在腔室上。

 使用 20 μL 移液器重新悬浮细胞混合物，并将 10 μL 的染色细胞放入血细胞计室。

注意：小心不要移动盖玻片。允许毛细作用将样品吸入。

 将血细胞计数器放在双目光学显微镜的载物台上。将显微镜调整到 10 倍放大倍率并聚焦在细胞上。

 使用手动计数计数器，计算血细胞计数器四个外部正方形中的每一个中的细胞（染色的细胞核）（图 1A），包括位于底部和左侧周边的细胞，但不包括位于顶部和右手边（图 1B）。如果在第一部分中使用了 3% 乙酸和亚-CH3蓝，则计算染色的细胞核。如果在第一部分中使用了台盼蓝，则计算未染色的活细胞。

图 1.血细胞计数器网格线

血细胞计数器图指示（A）四组红色和（B）其中一组应用于计数的 16 个方块。

注意： 适当的稀释系数将取决于起始样本中存在的大致细胞数量，但应使血细胞计数器中的细胞浓度为每平方（即大或主要正方形）50-100 个细胞。如果血细胞计数器上每个主要正方形的细胞多于或少于大约 100 个，请使用更大或更小的稀释因子制备新的稀释样品。

     血细胞计数器的九个主要方块中的每一个都代表 0.1 mm 3的总体积。由于 1 cm 3相当于 1 mL，因此可以使用以下等式确定细胞浓度：

有核细胞总数/mL = 每平方平均细胞数 x 稀释因子 x 10 4

示例：如果四个外部方块中的每一个的细胞计数在 100 稀释因子下分别为 21、15、20 和 17，则平均细胞计数将为 (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此，原始悬浮液中细胞的总浓度为：18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 个细胞/mL。

使用人工的细胞计数方法误差率较高，为提高细胞计数的准确度和细胞计数效率可以使用全自动细胞计数仪进行细胞计数。博大博聚旗下的全自动细胞细胞计数仪系列，具有多种规格供选择，可以满足不同的用户需求。

  苏州阿尔法生物实验器材有限公司十三年专注于生物反应器，生物反应器、发酵罐、PCR仪、凝胶成像、移液器、全自动细胞计数仪、显微镜、荧光显微镜、电泳仪、电泳槽等实验室仪器设备，生物反应器采用进口零部件，三重防污染密封设计工艺，有2L/5L/15L/75L/150L/200L等多种规格可以供选择，可用于生产 重组蛋白等创新药开发、生产。另外支持特殊定制已适应不同类型的客户，具有价廉质优、售后有保障基本实现了进口生物反应的国产化替代。