ATCC 细胞系原代细胞培养技术

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ATCC 细胞系和杂交瘤在干冰上冷冻在冷冻保存小瓶中运输，或在环境温度下作为培养瓶中的细胞培养生长物的运输。收到冷冻细胞后，重要的是要立即通过解冻和去除 DMSO 并将它们放入培养物中来恢复它们。如果这是不可能的，请将细胞储存在液氮蒸气中（低于 -130°C ）。不要将冷冻细胞储存在 -130°C 以上的温度，因为它们的活力会迅速下降。

培养基的制备

通过组装适当的培养基、血清和生长所需的其他试剂，为恢复细胞系做好准备。这些产品中有许多可从 ATCC 获得，并且可以与细胞系一起订购。这些试剂与 ATCC 用于细胞生长和保存的试剂相同。 虽然大多数细胞系可以在一种以上的培养基中复制，但当培养基改变时，它们的特性可能会改变。因此，建议在 ATCC 使用的相同培养基中开始细胞培养以获得最佳结果（参见产品信息表和 ATCC 网站）。

ATCC 细胞系的培养

1.准备一个培养容器，使其包含产品表中列出的推荐体积的适当培养基，并针对温度和 pH 值 (CO 2 ) 进行平衡。

2.在 37°C 或该细胞系的正常生长温度的水浴中轻轻搅拌，解冻小瓶。解冻应该很快，大约 2 分钟或直到冰晶融化。

3.从水浴中取出小瓶并通过浸入或喷洒 70% 乙醇来净化它。在层流组织培养罩中遵循严格的无菌条件进行所有进一步操作。

4.拧开小瓶的顶部，将内容物转移到含有 9 mL 推荐培养基的无菌离心管中。通过温和离心（125 × g 下 10 分钟）除去冷冻保护剂 (DMSO)。

5.丢弃上清液，将细胞重新悬浮在 1 或 2 毫升的*生长培养基中。将细胞悬浮液转移到含有*生长培养基的培养容器中，轻轻摇动*混合。

6.在24 小时后检查细胞培养物，并根据需要进行继代培养。这里需要注意的是一些细胞系，例如杂交瘤，需要几天时间才能从冷冻保存中*恢复。一些杂交瘤在培养的第一天存活率很低，会产生细胞碎片。在此之后，细胞培养将开始恢复并进入指数增长。

处理摇瓶内的培养物

一些 ATCC 细胞作为培养容器中的生长培养物运输。这些容器中接种细胞，培养以确保细胞生长，然后*填充培养基以进行运输。

收到摇瓶培养物后，目视检查培养基是否有微生物污染的宏观证据。这包括不寻常的 pH 值变化（酚红呈黄色或紫色）、浊度或颗粒。使用低倍（100 倍）倒置显微镜检查培养基中是否有微生物污染的证据以及细胞的形态。

如果细胞附着并以单层生长：

需要以无菌方式去除除 5 mL 至 10 mL 外的所有运输介质。运输介质可以保存以备重复使用，并应储存在 4°C。

在产品说明书中推荐的温度和 CO 2浓度下（37°C，大多数细胞系为5% CO 2 ）孵育培养瓶，直到细胞传代。

如果细胞未附着或悬浮生长：

将摇瓶中的全部内容物无菌转移到离心管中。

以 125 × g 离心 5 到 10 分钟。

除去 10 mL 的运输介质上清液，然后重新悬浮细胞。将此培养基的剩余部分储存在 4°C 以备后用。

根据细胞系，将重悬的细胞无菌转移到 25-cm 2烧瓶或 75-cm 2烧瓶中（参见产品表）。

在产品信息表中推荐的温度和 CO 2浓度下孵育细胞，直到细胞进行传代培养。

原代细胞的特点

由于大多数细胞系都是从一块切碎或酶分散的组织开始的原代培养物。原代培养物是几种细胞类型的混合物，保留了其源组织的特征。

一段时间后，原代培养物将达到汇合，即由于细胞膨胀而覆盖培养容器的所有可用空间的状态。此时，需要将培养物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）分解为单个细胞并进行继代培养（分裂、传代或转移）。在第一次传代之后，培养物通常被称为细胞系。随着随后的每次传代，细胞群变得更加均匀，因为生长速度更快的细胞占主导地位。也可以通过克隆从培养物中选出具有所需特性的细胞。

二倍体细胞系很少会超过几个种群倍增。它们的复制能力有限，在 20 到 80 次种群倍增后开始减慢并最终停止分裂。

1. 有证据表明，在细胞培养中观察到的一些细胞衰老可能是由于不适当的培养条件，而不是预先确定的复制衰老。

2. 还有一些数据支持某些物种（尤其是人类）细胞的复制性衰老，即使在改进的培养条件下生长也是如此。这种衰老是通过每次细胞分裂时染色体末端（端粒）的缩短来介导的。

3. 相比之下，连续（或永生化）细胞系具有无限的复制能力。这些细胞系通过永生化或通过多种方法中的任何一种进行转化而衍生自细胞系。许多连续细胞系来源于肿瘤组织。ATCC 集合中的大多数细胞系是连续的，但少数细胞系，例如 CCD-1117Sk 人类皮肤成纤维细胞 ( ATCC CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人类结肠 ( ATCC CRL-1459 ) 是有限的。

如培养容器部分所述，细胞系可以附着在表面（依赖锚固）或悬浮（不依赖锚固）生长。当细胞在单层或悬浮液中生长和分裂时，它们通常遵循由四个阶段组成的特征性生长模式：滞后、对数或指数、静止或平稳期和衰退期 。

滞后期 — 接种培养容器后，细胞立即缓慢生长，同时从传代培养的压力中恢复。

对数期或指数期 — 细胞进入指数增长期，持续到整个生长表面被占据或细胞浓度超过培养基容量。

静止期 — 细胞增殖减慢并停止。

衰退期——如果不更换培养基且细胞数量不减少，细胞将失去活力，数量减少。

为了确保活力、遗传稳定性和表型稳定性，细胞系需要保持在指数期。这意味着它们需要在进入稳定生长期、单层细胞汇合之前或悬浮液达到其推荐的最大细胞密度之前定期传代培养。为每个细胞系生成生长曲线有助于确定细胞系的生长特性。

苏州阿尔法生物13年专注于实验室仪器设备及试剂耗材行业，提供的细胞培养类的产品主要涵盖细胞罐、生物反应器、摇瓶、培养瓶、胰酶、培养基等几十个品种，如需 ATCC 细胞系生长和繁殖的详细信息，请参阅ATCC 网站上找到的特定细胞系产品表。