微生物菌种保存方法

标签：微生物 微胶囊 

  微生物应用技术在细胞工厂以及研究各种生物过程实验中起着重要作用，但是微生物的保存以及微生物培养的连续性一直是微生物应用领域的难题。实践证明，与在平板或发酵罐中连续传代培养微生物培养物相比，建立微生物库可以轻松实现微生物储存和检索。

根据储存时间的长短和微生物的种类，一般会采用不同的保存方法。长期保存的主要原理是保持微生物长期处于休眠状态，免受污染及遗传变化，直到使用时使其恢复生机。这种方法通常是通过使用低温和冷冻或干燥技术来减少细胞代谢活动来实现的。近年来，还有一种新型微生物保存技术是微胶囊化保存法，主要用于保存益生菌。

短期存储（持续增长）

微生物的连续生长可以在琼脂培养基上维持很短的时间。微生物的琼脂平板培养物在实验室冰箱 (4°C) 中可存活数周，而细菌培养物可在 4°C 下作为琼脂刺培养物保存长达一年。大多数微生物（细菌、真菌和藻类）都可以使用这种方法储存，推荐用于经常使用的培养物。使用培养基中的营养物质，这些培养物不断生长，尽管在较低温度下生长速度较慢，使它们能够在可用营养物质的作用下存活更长时间。

为了尽量减少琼脂的污染和干燥，培养板应用实验室薄膜牢固地包裹起来并倒置存放（琼脂面朝上）。在琼脂培养基上短期储存的主要优势是微生物容易回收。使用时，只需将它们划线到新鲜的培养板上或将它们接种到液体培养基中并在最佳生长温度下孵育！

然而，随着时间的推移，琼脂会变干，培养基中的营养物质会被微生物耗尽。代谢废物也会累积到有毒水平。营养缺乏和有毒废物的积累最终会导致储存的微生物死亡。

A. 使用直线将单个细菌菌落放入一瓶软琼脂中，然后孵育形成琼脂刺培养物。B.细菌在琼脂培养基板上划线并孵育。

长期储存

对于长期储存，微生物在低于冰点（-20°C、-80°C 或液氮）的温度下冷冻保存或冷冻干燥（冻干）。冷冻保存适用于范围广泛的细菌、藻类、真菌、病毒和原生动物。超低温会大大降低酶活性，从而降低微生物的代谢过程。为防止冰晶形成对细胞造成损害，在 -20°C、-80°C 或液氮 (-196°C) 下储存之前，将细胞重新悬浮在含有冷冻保护剂（如甘油）的生长培养基中。或者，细胞也可以在冷冻前重新悬浮在脱脂牛奶中 。为了最大限度地提高回收率，建议在细胞浓度最高的生长静止期冷冻培养物。大多数培养物可以在 -20°C 的低温小瓶（图 2）中储存至少一年，一些细菌原液在 -80°C 和液氮中储存时仍可存活数十年！冷冻微生物可以通过在 37°C 下解冻并接种到新鲜培养基中而复活 。

上图（微生物置于冻存管中）

冷冻干燥（冻干）通过在真空中将水转化为冰来去除冷冻样品中的水分，从而阻止微生物代谢过程并将细胞转化为干燥的颗粒，以便在安瓿中储存和运输（图 3）。冷冻干燥已被用于保存细菌、藻类、酵母、病毒和孢子形成真菌 。然而，冻干不适用于某些细菌和非孢子真菌，因为它们不能在冷冻干燥的压力下存活。在接种到新鲜培养基中之前，可以通过在生长培养基（细菌和藻类）、含有细菌宿主（噬菌体）或水（真菌和酵母）的生长培养基中再水化细胞沉淀来回收冻干培养物 

图3 。 含有冻干微生物的安瓿。

如何使用微胶囊保存微生物？

微囊化，是指细胞在储存前被包裹在基质中，属于一种长期的微生物保存方法，此法避免了微生物长期直接暴露于冷冻或干燥的严酷环境中。由于存在基质保护细胞，增加储存期间的稳定性。当在-80°C 下储存时，益生菌在藻酸钙中的微胶囊化已被证明可以提高它们的生存力。益生菌被包裹在纳米纤维和液滴当中可以保持较强活力。 

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