共聚焦显微镜的应用

什么是共聚焦显微镜？
共聚焦显微镜是激光共聚焦扫描显微镜 LCSM 的简称，它显微成像主要采用 3D 捕获的成像技术，使其具有较高的三维图像分辨率。这 些都是 通过构建显微照片来实现的。在荧光显微镜使用过程中，由于需要高强度紫外光辅助成像，所以显微镜 内的汞弧灯产生的强光可能会导致令人不安的背景噪音，甚至会导致光漂白。 共聚焦显微镜原理是通过数码相机针孔的高强度激光来实现数字成像的技术，有效避免了荧光显微镜 所产生 的问题。

共焦显微镜原理
共聚焦显微镜中的图像是来自一个焦平面的光通过针孔数码相机聚焦拍摄，从而规避 来自其支点上方或下方的光。固定在设备上的激光连续聚焦在样品的选定区域，同时，被样品吸附的荧光染料也会被数码相机捕捉。共聚焦设备包含两个旋转镜头用来拍摄组图。

然后通过所累积的不同焦平面的图像序列，使用软件编译完整的 3d 图像。此图像可以在轴向（z 轴）和横向（x 和 y 轴）平面进行微调。这些细胞和其他矩阵的再现是通过使用双倒置的光锥照亮物体来实现的。

使用标准落射荧光显微镜所存在的问题是当遇到较厚的基质或标本时所表现出的荧光程度较大。大于 2 微米的样品发出的辐射会危及生成图像的准确性，从而损失成像的细节。而共聚焦显微镜则可以通过缩小激发范围并使用光学切片来消除背景噪声。



共聚焦显微镜的应用 

ECM模拟凝胶的成像
细胞外基质 (ECM) 或属于所有细胞的非细胞成分，在细胞功能中是重要的。ECM 的弹性调节细胞的许多生物学功能，例如间充质干细胞的分化、粘附和迁移。

细胞生物学中常常通过水凝胶来模拟ECM。共聚焦显微镜的应用主要在于可与聚丙烯酰胺凝胶的压痕法结合使用。共聚焦自动图像成像可以有效测量 ECM 模拟中的压痕和穿孔。比如，共聚焦激光显微镜可以测量出 PAAM 凝胶组合物的深度和刚度。这种方法可以替代 AFM 纳米压痕法和微针法。
由于共焦成像可以可靠地探测大多数样品表面下方 0-200 µm 之间的任何位置。然而，重要的是要注意，每个样本都有自己的深度，在该深度处散射、光漂白和噪声太高。据说有些标本应该*避免使用共聚焦显微镜。

替代双光子显微镜功能 
双光子显微镜或多光子显微镜产生两个光子来完成一个光子的工作。当获取两个光子，每个光子具有一半的能量，快速连续退出时，这个过程将取决于撞击样品的光强度的平方。

以大约 100 MHz 脉冲的红外激光器将使失焦光比聚焦光暗得多。

双光子显微镜的散射光不会激发荧光，因为它使用的红外波比高强度激光散射的少。这将较大程度地减少信号损失并可以穿透大约 1 mm 的组织，超过共聚焦显微镜穿透 200 μm 组织的能力。较低能量的红外光对细胞造成的损害也会降低。

根据电子显微镜的成像规则，我们可以知道共聚焦显微镜的分辨率远高于双光子显微镜。虽然，共焦显微镜比传统的荧光显微镜要强大得多，但双光子显微镜和透射电子显微镜的市场应用更为普遍。 

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