使用细胞转染构建稳定细胞系的方法

使用细胞转染构建稳定细胞系的方法

细胞系的稳定对于其广泛应用具有重要作用。经过细胞转染后的稳定细胞系适用于重组蛋白的生产、基因功能研究以及药物发现分析。目的基因在细胞系中稳定表达，克服了瞬时表达转染效率低的问题，产生更多的目的蛋白。
 实现细胞系的稳定主要有两种途径：一种是通过真核载体实现，该载体在转染细胞的细胞核中含有用于附加体维持的元件。另一种是通过将转染的质粒直接整合到靶细胞基因组中来实现。由于附加型的稳定性比较有限，附加型质粒元件通常仅限于某些物种，因此通常使用整合到宿主细胞染色体中。这种方法所预期的基因修饰的稳定性通常要高得多。
产生稳定细胞系的主要挑战是低转染效率和整合频率。使用的转染方法可能直接影响到细胞的稳定的表达。我们知道脂质体转染法中的脂质体试剂可用于将 DNA 转移到贴壁细胞系中。而电转染法主要用于难以转染的悬浮细胞系中。但是电转染法会受到一些限制，例如载体生产效率和安全问题，而而且电转染法的细胞存活率较低
选择标记
   为了选择稳定转染的细胞，选择标记必须与靶蛋白共表达。标记基因可以在同一个质粒载体或第二个共转染载体上。有多种系统用于选择转染细胞，包括对抗生素嘌呤霉素、新霉素、DHFR 和谷氨酰胺合成酶的抗性。基因转移后，细胞在含有选择剂的培养基中进行培养。只有那些含有耐药基因的细胞才能存活。
产生稳定细胞系的方法
根据实验的范围，有几个选项可用于生成稳定的细胞系。耐药细胞的混合群体可以直接用于实验分析，其特点是快速产生结果，但也有处理不确定和遗传混合细胞群体的缺点。还有一种办法是生成单克隆细胞系。在这种方法中，需要通过在 96 孔板中铺板来稀释抗性细胞，以便培养为单个和分离的细胞。随后，可以重复多次克隆单细胞以获得全部的克隆纯度。总之，根据目的表达类型和您要整合的构建体，可以有许多不同的方法来生成稳定的细胞系。
稳定细胞系的形成条件
   所选细胞类型的培养条件（传代、分裂节律、数量等）对于稳定细胞系的产生尤为重要。正常情况下，为了促进良好的增殖和细胞生理，细胞系应在实验前两天进行传代。此外，细胞通道不应高于30，因为可能会干扰集成效率。
实验步骤如下：
1.选择G418浓度
   由于不同细胞系之间对于 G418反应是不同的，许多细胞系会随细胞传代次数而发生变化。这个时候就需要通过实验确定特定细胞类型的选择条件（例如 G418 浓度、铺板密度）。确定低水平的 G418 浓度，从而减少对细胞的生长的影响。需要注意的是库存 G418 的活性浓度也可能因批次而异。因此，我们建议对每个新批次测试 G418 灵敏度。具体方法如下：

l 在板的每个孔中预板 100 μl 培养基。
l 在第一列 (#1) 中加入 100 μl 每孔含有 4000 个细胞的细胞悬液。
l 轻轻上下移液后，将 100 μl 移至下一列，从而以 1:2 的比例稀释。对每个连续的列重复此过程。
l 完成后从末列 (#12) 丢弃 100 μl。第一列每孔应包含约 2000 个细胞，末列平均每孔包含约一个细胞。
l 将 100 μl 含有 G418 的培养基 (2.8 mg/ml) 添加到第一行 (A)，使 G418 的终浓度为 1.4 mg/ml。
l 将 G418 添加到以下行中，以逐步降低 G418 的浓度至 0.2 mg/ml。末行 (H) 添加不带 G418 的培养基。
l 在标准条件下孵育细胞。
l 通过显微镜分析细胞生长。在某些情况下，细胞生长也可以通过培养基颜色的变化来观察。
l 如果您在没有 G418 的孔中观察到细胞生长（10 天后），可以合理地假设这些细胞可以从单个细胞开始生长。
l 选择略高于显示全细胞死亡的 G418 浓度作为适当的 G418 浓度进行选择。
2. 细胞转染
对于转染，可以使用转染试剂盒将含有靶基因和耐药基因序列的表达质粒直接转染细胞中。这个过程中尽量设置未转染细胞的阴性对照组以进行选择。可同时用 GFP 对照质粒来检查实验的转染效率和整合频率。
3. 转染后的细胞选择
转染后，让细胞生长并在非选择性条件下表达 G418 抗性蛋白约 24-48 小时（根据您的转染系统达到蛋白表达峰值）。
直接使用悬浮细胞或用胰蛋白酶消化贴壁细胞进行分析。在转染后 24-48 小时通过显微镜或蛋白质印迹分析您的靶蛋白和阳性对照，分析转染效率。
通过台盼蓝染色或其他适当的方法计数活细胞。
使用针对细胞类型预先测试过的标准培养基和适量的 G418，将细胞置于 96 孔板中，每孔具有不同的细胞数（例如，0.5、1、2、5、10），体积至少为 100 μl每孔。根据之前确定的细胞浓度，连续稀释。在播种前悬浮细胞很重要，但要避免通过频繁移液进行苛刻的处理。
一旦出现未转染的对照孔中的细胞全死亡，就可以分析或进一步扩增细胞克隆。
4. 稳定细胞系的分析
一旦获得抗性细胞系，应该扩增细胞并与阳性和阴性对照比较靶基因。稳定细胞系的分析主要包括蛋白质印迹、显微镜检查、ELISA，以及流式细胞术等方式来检测融合蛋白的表达。
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