Western实验步骤

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，常简写为WB，是用抗体检测蛋白表达的重要方法之一。碧云天试剂总结Western实验步骤可如下进行操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

根据实验需要，使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013/ P0013J)、RIPA裂解液(P0013B/ P0013C/
P0013D/ P0013K)、 NP-40裂解液(P0013F)或SDS裂解液(P0013G)等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品；为了防止蛋白的降解，或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定，也可额外添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂混合物( P1005/ P1006/P1045/ P1046/ P1112/P1113)。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒( P0027和P0028)、 细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033)、 细胞线粒体分离试剂盒(C3601)、 组织线粒体分离试剂盒(C3606)。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒( P0009/ P0010/ P0010S/ P0011/ P0012/ P0012S)、 Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(P0006C)。

2.电泳(Electrophoresis)
(1)  SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天试剂、天能SDS-PAGE凝胶预制胶、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0012AC)。这两种试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。更方便的，可以使用碧云天的各种浓度规格的预制胶产品( P0050/ P0051/P0052/ P0053/ P0055/ P0056/ P0057/ P0058)。

(2)  样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)或 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0015L)。 如果是非变性样品，可以使用 非变性PAGE蛋白上样缓冲液(P0016)或非变性非还原性蛋白上样缓冲液(P0016N)。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3)  上样与电泳

蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

碧云天提供各种预染蛋白质分子量标准用于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。最好使用彩色预染蛋白质分子量标准(P0068/P0069/P0071/P0072/ P0075/P0076/P0077/P0078/P0079/P0080)或预染蛋白质分子量标准( P0066/ P0067)。

电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer )

我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP24/FFP26/ FFP28/FFP32/ FFP33/ FFP36/ FFP39),其中推荐使用PVDF膜(进口分装，6.6×8.5cm,0.2μm) ( FFP24/FFP26)。PVDF膜在使用前须经浸润和活化，推荐使用碧云天生产的安全无毒的 PVDF膜浸润活化液(P0021S)。也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜) ( FFN02/ FFN03/FFN05/FFN06/ FFN08)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

转膜时推荐使用碧云天生产的高品质转印滤纸(7.5×10cm) (FFP51)。 转膜时的溶液推荐使用碧云天的Western转膜液(P0021A/P0021B)。

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4.封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)的Western洗膜盒(FFX050/ FFX052/ FFX055)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

用微型台式真空泵(E0110/E0111/ E0112/E0113/ E0114/ E0115)或滴管等吸尽洗涤液，优先推荐加入适量的 QuickBlock™ Western封闭液(P0252)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭10分钟；也可以加入 Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，两种封闭液都可以适当延长封闭时间，如有必要甚至可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的 侧摆摇床( E0016-E0030)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

5.一抗孵育(Primary antibody incubation )

参考一抗的说明书，按照适当比例用QuickBlock™ Western一抗稀释液(P0256)或Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗, ，碧云天提供了近千种 优质一抗。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

回收一抗。加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体(AT819/AF0001)、Actin抗体( AA128/ AF0003)或GAPDH抗体(AG019/ AF0006)，进行内参检测。

6. 二抗孵育(Secondary antibody incubation)

参考二抗的说明书，按照适当比例用QuickBlock™ Western二抗稀释液(P0258)或Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有 多种二抗提供。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7.  蛋白检测(Detection of proteins) 

参考相关说明书，使用BeyoECL Star (P0018A)或BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒( FFC58/ FFC83)进行。也可以使用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒( P0202/ P0203)、TMB显色液(组化或膜HRP显色用) (P0211)或 BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用原柯达生产的生物实验专用X-OMAT BT胶片( FF057/ FF081)。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery ) 

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025/P0025B/ P0025N/ P0025S)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

实验试剂由苏州阿尔法生物提供。