使用流式细胞仪检测血小板的注意事项

 通过使用使用流式细胞仪可以对血小板进行信号传递、细胞骨架 架构、糖蛋白结构、血小板活化反应， 糖蛋白缺陷检测， RNA含量，血小板抗体等分析检测。使用流式细胞仪进行血小板分析检测时需要注意以下几点：
一)抗体的选择
选择CDWorkshop中的单克隆抗体.单克隆抗体反应特异性高,非特异性结合少,
但由于血小板富含FcRⅡ(CD32,Fe Ⅱ受体),而Fc受体对不同抗体亚类具有不同亲和力,所以在业类选择上,对于人的抗体以选择IgG1为好.
二)抗凝剂的选择
尽量避免使用肝素;EDTA在室温20~25℃时其抗凝效果与枸椽酸盐无差别,但在37℃时,EDTA就会影响蛋白结构及刺激血小板活化.
三)标本的采集
般采少量外周血,收集在玻璃容器或塑料容器中,采血中避免组织液流人血液中;防止气泡产生;并使用大号针头(如18号).尽量减少化学、物理的激活因素对血小板的活化作用.标本的放置温度以15-25℃为宜,4~10℃以下血小板的外形发生改变.
四)抗体标记物的选择
我们知道,FITC和PE标记是常用的在488nm激发下作为双标记使用的试剂,PE的荧光强度比FITC强.因为在用单色测定中CD62p和CD63在静止血小板上均为弱表达,检测这两个抗原时用PE标记为宜.而当CD62p和CD63配合一个高强度表达的抗原CD41、CD61或CD42b作为双标记时,CD62p和CD63却宜使用FITC标记.
五)样品固定
使用流式细胞仪同样可以检测样本中的血小板反应力及活化进程；样本的固定的主要目的为了减少血小板的体外活化,在进行样本固定时，也可能会破坏部分蛋白质结构,从而增加非特异性染色.所以,除了做体外剌激血小板活化研究和不能及时处理标本外,都应该做标记之后再固定.样本固定剂一般使用0.5%~1.0%的多聚甲醛即可.
六)缓冲液
在孵育和洗涤过程中经常会使用PBS(0.01 mol/LpH7.2)+BSA.但如果是分析血小板活化过程，由于Tyrode缓冲液中主要含有镁离子和grape sugar,这两种物质有利于减少血小板的体外活化。所以在洗涤的时候,也可以使用Tyrode缓冲液。
七)仪器的设置
部分的流失细胞仪需要利用荧光微球微球进行仪器光路和光电信号的控制,使仪器保持相对稳定、灵敏的状态.当数据采集完成以后,散射光和荧光需要使用对数放大,这时通过调节散射光电压,使细胞群分布尽量保持在中间位置.调节荧光电压,使样品继发荧光强度落在对数值1内,也可以使用荧光微球或者使用CD4-FITC/CD8-PE双色标记单抗来做荧光补偿.标本至少分析5000个细胞,而且每秒流速不宜超过1000~1500个细胞.
八）数据分析
在活化血小板(CD62p、CD63)等少量表达抗原的检测中,阈值的设定一般是使非特异性染色的比例控制在1%~2%的范围内,但要对非特异性染色进行正确的设定依靠仪器的敏感度及试剂的质量.当测定的抗原本身为高表达而要判断抗原表达的高低度时,需要依据平均荧光强度。
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