Trizol试剂的使用方法

该法从细胞中提取RNA--用匀浆器将组织磨碎，加入TRIzol处理组织。5分钟后加入氯仿，以每分钟12000转离心5分钟，样品即分成水样层、中间层和有机层。

※RNA存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA来还原。

※在除去水样层后，中间层中的DNA和蛋白质也能相继以沉淀的方式还原:乙醇能使中间层的DNA沉淀析出，在中间层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。

每100ml TRIzol可以抽提100个六孔板中的样品或100个50-80mg的组织样品。无论样品是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(约五百万个)及大量的组织(≥1g)和细胞(超过一千万个)均有较好的分离效果。

每一百万细胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克组织用TRIzol抽提可得1-10微克RNA(产量因细胞和组织不同而异)。

TRIzol操作上的简便性允许其同时处理多个样品，所有的操作可以在一小时内完成。

TRIzol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白质的污染，故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和单分子克隆(PCR)。

※如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

※TRIzol试剂能促进不同种属、不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA经过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15kb之间的不连续的高分子量条带(mRNA和hnRNA成分)，两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间 (tRNA,5S)。当抽提的RNA用TE稀释时，其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。

TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。

⒈样品的制备 当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2-8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。

⒉ 分离阶段 将匀浆样品在15-30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2-3分钟。在2-8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。

⒊ RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 ml TRIZOL对应0.5 ml异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10分钟并在2-8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4 .RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

⒌ RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在55-60°C下孵育10分钟(当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。)RNA还能被100%甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在–70°C。