应用差速离心法分离外泌体的原理

外泌体是一种小的 (40-100 nm) 细胞外膜囊泡，目前进行外泌体分离的普遍方法是差速离心法。

     应用差速离心法和粒径分析等是细胞外囊泡 (EV) 研究的重要步骤。已知细胞会分泌许多膜囊泡，这些囊泡的大小、分子含量及其形成机制各不相同 具体取决于细胞的类型 和当前状态。通常可以辨别出三个主要的 EV 群体：凋亡小体、脱落的囊泡和外泌体  . 凋亡小体是已知较大的囊泡，直径为 800-5000 nm，由凋亡后细胞的细胞质和质膜成分组成。脱落的囊泡和外泌体由非凋亡细胞释放。脱落的囊泡，也称为“胞外体"或有时称为“微泡"，是由质膜起泡产生的，一般的粒径尺寸范围为 (50– 1000 nm)。

   外泌体是内吞起源的小 (40–100 nm) 囊泡群。外泌体和脱落的囊泡都含有特定的蛋白质组、RNA 和, dsDNA 等。不同的细胞外环境富含不同类型的细胞外囊泡。即使由相同的细胞类型形成，不同类别的囊泡也具有不同的核酸特征  。

差速离心法的原理

离心管内粒子的速度，由三种力（离心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力）的平衡决定，如：

其中geff为离心力（加速度），R为旋转半径，即粒子距旋转轴的距离，ω为旋转角频率，d为粒子直径，ρ为质量粒子的密度和 ρ solv和 η 分别是介质的密度和粘度。

    在固定的离心条件（转速和介质成分）下，粒子速度由粒子的形态和密度决定。密度高于介质密度的粒子沿离心力“向下"运动，而比介质轻的粒子沿与离心力相反的方向“上浮"。对于相似的密度，较大的粒子迁移得更快。因此，在生物学中，离心主要用于按大小（差速和速率区带离心）或按密度（等密度离心）分离不同的物体。在这项研究中，我们专注于使用差速离心按大小进行颗粒分级。

       与等密度和梯度离心相反，差速离心从离心管内颗粒的均匀初始分布开始。在开始一轮离心过程中，位于管底部附近的一部分目标小颗粒不可避免地与较大颗粒共同沉淀。这种共沉淀导致较小颗粒的产量降低。然而，选择大颗粒，起初位于管半月板附近，在开始一轮离心过程中可能没有足够的时间到达管底，从而污染最后一个离心步骤产生的小颗粒颗粒。

       显然，交叉污染的程度取决于不同粒子群的相对沉降速度和离心条件。在被分离的粒子的沉降速度之间存在显着（数量级）差异的情况下，可以有效地优化差速离心协议以获得目标粒子群的高产量和足够纯度。此外，当不同颗粒部分之间的沉降速率仅存在微小差异时，优化过程不太成功。在这些情况下，取决于离心条件。

       任何外泌体分离方案旨在获得产量合理且不受细胞碎片、细胞器和凋亡小体污染的外泌体群体，理想情况下，不含其他类型的细胞外囊泡、蛋白质及其聚集体。由于大小差异很大，将外泌体与细胞、细胞碎片和大囊泡分离相对容易。巨大的挑战是从小的脱落囊泡中纯化外泌体，因为它们的大小非常相似。通过差速离心分离这些细胞外囊泡既困难又低效。所以需要根据转子的特性和要分离的颗粒的特性，来对离心参数应进行调整。因为离心速度与粒子的旋转半径成正比，所以离心运动加速。粒子的径向坐标随时间t呈指数增长。

离心机转子的选择

    使用差速离心法分离外泌体主要需要注意的是转子的选择。“摆动桶"(SW) 转子和“定角"(FA) 转子， 这些转子的几何形状根本不同，因此沉降特性也不同。这些转子之间的主要区别在于： FA 转子，与旋转半径相比，沉积颗粒的较大路径长度通常较小，允许近似恒定迁移率并简化描述。然而，第二个区别是圆形 FA 管的水平横截面是椭圆形的，不同粒子的路径长度根据轨迹与椭圆长轴的距离而不同。由于较短的路径长度，外围颗粒可能沉降得更快，需要根据不同的实验需要进行选择。

苏州阿尔法生物提供的超速离心机、低速离心机、落地式离心机、台式离心机、纳米粒径分析仪广泛应用于差速离心法分离外泌体及外泌体形态、电位、粒径分析等实验。