细胞培养常见问题汇总

1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入 37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用 5 %或 10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

9 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

10 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为 300xg (约1,000rpm)，5 - 10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

12 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

14 DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 之 DMSO(如 Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐DMSO 之 Nylon 材质滤膜。

15 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 C 30~60 分钟 → (-20 C 30 分钟) → -80 C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 C 至–80 C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 C 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

17 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染的好方法。

18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素，直接灭菌后丢弃之。

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

20 支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

22 CO2培养箱之水盘如何保持清洁？定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

23 为何培养基保存于4℃冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4℃冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。

24 各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？不同厂牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。

25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

28 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在DMEM 或M199 中同样很容易生长。总之， MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养可选 AIMV（12005）培养基（SFM）。

29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

30 GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎降解完成。

31 什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

33 目录上说，Hank’s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和 Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用 Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

34 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

35 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

37 大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。

38 在溶解的一周内使用贮存在 4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过 30 分钟，就会变得不稳定。

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