动物细胞培养生物反应器中乳酸含量的控制方法

铵产量过多、乳酸产量过剩、营养限制或与营养补给、添加碱以控制 pH 值相关的高渗应激等因素，使得动物细胞培养生物反应器中的细胞密度被限制。

为了部分克服这些因素，使用乳酸补充和适应LSA 技术是减少铵和乳酸产生的一种简单方法。使用这种简单的方法，可以实现了将近乳酸产量的大幅度减少，同时在分批摇瓶培养中减少了 50% 的铵产量。在随后的补料分批生物反应器培养中，使用Biosen C-Line 乳酸分析仪测定乳酸产量减少了近8八倍。甚至可以实现 3500 万个细胞/mL 的活细胞密度和 2.73 亿个细胞-天/mL 的完整活细胞天数。

减少乳酸和铵盐产量的方法总结

在动物细胞培养领域，许多研究人员观察到乳酸和铵积累会严重影响到 细胞的生长。 60多年来，科学家已开发出多种方法来减少乳酸 和铵的产生。

 常用方法汇总见表

        大约在过去 35 年里，随着生物制药行业生物反应器动物细胞培养从低密度分批培养转向高密度补料分批培养，乳酸和铵积累方面 的挑战大幅增加。减少乳酸积累制造创新药物的基本要求是：

(1)在所有与工业相关的细胞系和工艺生产过程中，将乳酸和铵的产量降低到足够低的水平，以免对细胞生长和产品质量产生负面影响，

(2)在根据当前良好生产规范 (cGMP) 运行的大规模工业生产中。

  为减少乳酸积累曾经尝试过用替代糖替代葡萄糖，当时，人们并未广泛认识到铵积累可能是一个问题，因此未报告有关铵水平的数据(NR)。事实上，许多早期这样的方法以及许多目前的方法都减少了乳酸的产生，但增加了铵的产生。当测试用于补料分批培养时，替代糖（例如半乳糖）有时会导致与葡萄糖类似的生长。

   相对低水平的铵，通常在 2到10 mM 之间，可能对细胞生长和生产力以及糖基化产生负面影响，甚至可能对某些重组糖蛋白的生物活性、稳定性和/或免疫原性产生负面影响。铵是动物细胞培养中重要的抑制性代谢物之一。铵的负面影响通常在比乳酸（例如 20–40 mM）低大约十倍（例如 2–4 mM）的浓度下实现 。因此，以氨的少量增加为代价来减少乳酸当然是不可取的。

        将培养基中的葡萄糖控制在低水平——以限制葡萄糖对细胞的供应——已被用于减少乳酸产生超过三十年。这可以通过多种方式实现，例如直接测量和自动或手动反馈控制葡萄糖水平。当葡萄糖而非谷氨酰胺被控制在低水平时，通常会发生葡萄糖摄取和乳酸生成的理想减少，但这通常与谷氨酰胺摄取和铵生成的不良增加密切相关. 因此，为了尽量减少乳酸和铵的产生，可能需要同时控制葡萄糖和谷氨酰胺。

 关于生物反应器细胞培养过程中的葡萄糖乳酸含量的测定可以使用Biosen C-Line 乳酸分析仪，该仪器使用外部传感器系统对葡萄糖和乳酸水平进行样品测试，根据反应罐内的养分消耗和细胞代谢状态来适当进行补料。

 目前，许多研究人员还尝试开发代谢工程方法来减少乳酸或铵的产生。总的来说，事实证明，通过基因工程改善代谢表型比 1980 年代最初设想的要困难得多。所以，除了 GS 方法之外，迄今为止，还没有其他减少乳酸 或氨产量的代谢工程方法在工业中得到广泛采用。

其实，当前有四种简单而常用的减少乳酸和铵产量的方法：

(1) 降低培养温度

(2) 降低培养 pH

         (3) 向培养基补充铜

         (4) 选择具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆。

         尽管所有这些方法都被普遍采用，但需要注意的是，这些方法均不能普遍减少乳酸和氨的产生。温度和 pH 变化通常根据具体情况进行优化，可能对细胞生长和/或产品质量 产生负面 或正面 影响。虽然 pH 值下降通常会减少乳酸产量 ， 但它也会导致谷氨酰胺 消耗和铵产量增加 。铜补充剂是一种简单的方法，但不会减少所有相关细胞系的乳酸产量，并且还会对产品质量产生积极或消极的影响。 选择具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆本质上并不普遍，因为它需要具有特定生产力、产品质量或其他潜力的克隆可能会由于缺乏 LC 表型而被丢弃。对于某些克隆，LC 表型可能由于未知因素偶尔会丢失，即使在经过验证的 cGMP 工艺生产商业产品中也是如此。

   LSA 技术 减少工业细胞培养中乳酸和铵产量

     近年来，一种减少生物反应器动物细胞培养中乳酸和铵产量的新方法被提出。这种方法就是LSA 技术，它主要采用乳酸补充培养基等方式来实现。使用该技术，补料分批培养物可生长至每毫升 3500 万个细胞的活细胞密度。这个数据远高于行业所公布 的每毫升5-45 百万个细胞的值。同样，实现的每毫升 2.73 亿个细胞日的 IVCD 值也与行业所公布的每毫升30-2.75 亿个细胞日的值相当。

LSA 技术作为一项新兴起的技术在细胞培养行业尤其是大规模细胞培养行业、生物制药行业发挥着重要作用。

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