Transwell实验的步骤

    本文主要介绍 4种 Transwell实验的实验步骤，具体包括：Transwell 肿瘤细胞迁移实验、Transwell 上皮细胞培养实验、Transwell B16 细胞的体外迁移实验、Transwell内皮细胞HMEC-1迁移实验。
一、Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×10°，而迁移实验的密度是1×10°。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。
二、Transwell上皮细胞培养
1.将雄性 wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100ug/mL链霉素、无Ca²t、无Mg²t、无血清的MEM。
2.用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
 
3.离心后立即用新鲜的上述 MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的LHC-8 medium 冲洗一次。
4.冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于 90%，则将细胞以10°/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12mm），以37°C，5%CO2-95%空气，含5%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的LHC-8medium 孵育6~10天。
5. 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000-2000Q之间，即可用于电生理试验。显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片。
三、Transwell B16细胞的体外迁移实验
把 Transwell 倒置，在 Transwell 的 PVPF 膜（0.8μm）的下表面涂一层fibronectin（10 μg/mL，50μL），37 度 2小时，PBS 洗一遍后，放入预先每孔加有600μL的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100μL，用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。
 
四、内皮细胞HMEC-1迁移实验
    1%明胶处理的Transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后上室加入 100μL 用serum-free MCDB131稀释的5×104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移同时设置相应阴性及阳性对照，置于COa培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并拍照，最后用10%乙酸100μL/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=【（OD 值给药组-OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照）×100%。
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