单层细胞系传代培养指南

大多数细胞系和原代细胞培养物生长为单一厚度的细胞层（单层）或附着在玻璃或经过特殊处理的塑料基质上的薄片。为了保持培养物的健康和积极生长，通常需要定期对它们进行传代培养。

   常见的传代培养方法涉及通过使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶或胶原酶）破坏细胞间和细胞与基质的连接。在细胞解离成主要由单细胞组成的悬浮液后，将它们稀释并转移到新的培养容器中。在那里它们可以重新附着并开始生长和分裂，经过一段时间的孵化后再次接近汇合。此时，它们可以再次进行传代培养或用于实验。

   以下指南描述了典型单层细胞培养的常规传代和维护所涉及的基本原则。为了获得一致的结果，保持良好的记录很重要。记录应包括细胞传代日期和传代次数。

细胞周期性检查

定期仔细检查培养物以确定其状态和健康状况是一种很好的做法。用肉眼检查培养容器中的内容物，寻找微生物污染的宏观证据，例如意外的 pH 值变化或培养基中的浊度和颗粒。还要寻找通过显微镜可能不容易看到的小真菌菌落。这些菌落可能漂浮在介质-空气界面上，尤其是在容器边缘周围。

其次，使用倒置显微镜检查一般细胞形态和生长模式。仔细寻找微生物污染的任何微观证据。在某些细胞系中，漂浮在培养基中的细胞是细胞死亡的标志。然而，许多细胞在有丝分裂期间聚集，形成非常折射（明亮）的球体，如果培养物受到物理干扰，这些球体可能会自由漂浮。死细胞通常会聚集并分离，但通常不会折射。

除了这些日常检查外，定期培养细胞进行真菌和细菌检测，并检测支原体污染情况。有几种方法可用于检查这些污染物。有关支原体检测试剂盒和细胞培养试剂的信息，请参阅苏州阿尔法生物实验器材网站。

准备培养基

准备推荐用于细胞系的新鲜培养基，并适当标记培养容器。一定要添加补充剂并平衡 pH 值。在一个 75 cm 2 的烧瓶中，使用大约 12 至 15 mL 的培养基。相应地调整其他培养容器的体积。

收获细胞

大多数细胞培养物如果在达到汇合之前进行传代培养（仍然有一些可用的生长空间），则生长最好。这将有助于使细胞保持在活跃的对数生长期。应始终在为每个细胞系维护的记录表上注明任何异常观察结果。收集步骤旨在将细胞从其基质中去除，并尽可能温和地破坏细胞间的键合。对于大多数细胞培养，这需要在缓冲盐水溶液中使用化学或酶解离剂。

  胰蛋白酶 是常见的解离剂，通常以 0.05% 至 0.25% 的浓度使用。适宜工作浓度通常是通过使用min浓度的胰蛋白酶来确定的，该胰蛋白酶会在相对较短的时间内（10 到 15 分钟的孵育）从基质中去除细胞并产生单细胞悬浮液。有些细胞比其他细胞更难分离，因此胰蛋白酶溶液经常添加酶（如胶原酶）或螯合剂（如 EDTA）以改善结果。

    在含有哺乳动物来源血清的培养基中生长的细胞需要洗涤以去除血清，因为胰蛋白酶会受到其存在的抑制。残留血清通常是胰蛋白酶溶液无法将细胞与底物和彼此分离的原因。有多种缓冲盐溶液可用。通常是基于Hanks 缓冲盐水溶液、Earle 缓冲盐溶液或 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐溶液的改进。如果要将这些制剂用于解离细胞，通常会将这些制剂修改为不含钙和镁 (CMF-PBS)，因为这两种离子在细胞与细胞和细胞与基质的附着中起着重要作用。

收获单层细胞的步骤 

1.取出并丢弃培养基。

2.用 5 mL 的解离溶液冲洗细胞片并取出。（本协议中使用的量适用于 75 cm 2烧瓶；对于其他容器中的培养物，按比例减少或增加量。）如果解离溶液含有胰蛋白酶，则去除所有痕量的血清非常重要，其中含有胰蛋白酶抑制剂。

3.添加 2 至 3 mL 的解离溶液。每 5 分钟用倒置相差显微镜检查一次酶处理的进度。特别难以分离的单分子层可置于 37°C 以促进分散。酶溶液的预热也会缩短暴露时间。为避免结块，在等待细胞分离时不要通过敲打或摇动烧瓶来搅动细胞。

4.使用移液器将 6 至 8 mL 生长培养基添加到细胞悬浮液中，并从培养容器底部清洗所有剩余的细胞。此时，倒置显微镜的快速检查应显示细胞悬浮液由至少 95% 的单细胞组成。5.如果不是这种情况，则可能需要更剧烈的移液。

6.收集细胞悬浮液，根据需要计数或分种接种物，然后分配到准备好的培养容器中。对于某些细胞系和酶溶液（胶原酶），有必要在分配（接种）细胞之前通过温和离心（125 × g 5 分钟）去除酶。

计数细胞或分裂悬液

 为了确定生长速率或建立已知浓度的培养物，有必要对悬浮细胞进行计数。可以使用血细胞计数器或电子细胞计数设备。血细胞计数器的优点是价格较低，同时可以进行存活率测定。

  轻轻混合细胞悬浮液并取出 0.5 mL 等分试样进行计数。向其中添加 0.5 mL 用于细胞计数的重要染色剂，例如台盼蓝或赤藓红 B。混合均匀，取出样品，然后小心地装入干净的血细胞计数器。

    确定细胞悬浮液的实际浓度（细胞数/mL）和存活率百分比，并计算以适当密度接种每个传代培养物所需的悬浮液体积。悬浮液通常不计数细胞，而是分散在多个培养容器中。例如，1:2 拆分意味着将一个容器的细胞悬浮液分成两个新容器，通常具有相同的表面积。这种方法适用于细胞系的日常维护，其中跟踪准确的细胞密度并不重要。 

平板培养

将细胞悬浮液的适当等分试样分配到准备好的容器中（将浓缩细胞悬浮液添加到空培养容器中会导致细胞附着和生长不均匀）。生长较快的培养物通常在较低浓度下建立。除非最初添加min浓度的细胞，否则一些培养物不会生长良好。然而，大多数培养物在 10 3到 10 4 个细胞/cm 2或更高（7.5 × 10 4到 7.5 × 10 5个细胞/75-cm 2烧瓶）的初始浓度下会茁壮成长。 

重新培养培养物

将培养物放回振荡培养箱中。大多数哺乳动物细胞培养物在 35°C 至 37°C 之间的稳定温度下表现较好。除了保持恒定温度外，用于培养皿和多孔板等未密封培养物的培养箱还必须保持高湿度和二氧化碳水平。高湿度减少了未密封培养容器中的蒸发损失，这会导致培养基变得高渗并对细胞造成压力。如果与含有适量碳酸氢盐的缓冲系统一起使用，升高的二氧化碳水平（通常为 5% 至 10%）有助于维持适当的 pH 值（7.0 至 7.6）。

   为了使这种类型的缓冲系统起作用，有必要使用未密封（松开的盖子）或透气的培养容器进行气体交换。如果没有CO 2 ，缓冲系统可以在密闭容器中保持适当的 pH 值。

   第二天检查培养物以确保细胞重新附着并活跃生长。根据需要更换介质；对于大多数活跃生长的培养物来说，更换周期为约为每周 2 到 3 次。

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