HE染色实验中常见问题及应对措施

HE染色实验常见问题及解决方案

    HE染色是石蜡切片技术中常用的染色方法之一，简称为苏木精-伊红染色法。该方法使用碱性的苏木精染液将细胞核内的染色质和胞质内的核酸染成紫蓝色，同时使用酸性染料伊红将细胞质和细胞外基质中的成分染成红色。
 
1、切片出现白色斑点
原因：(1) 烘片温度过低，导致玻片未干透；(2) 切片在二甲苯中停留时间过短；(3) 二甲苯使用时间过长，导致脱蜡不效果不好。
对策：若玻片未干透，先用无水乙醇去除水分，再重新脱蜡。若斑点是由于停留时间过短或使用时间过长造成的，则需重新操作，延长停留时间或更换二甲苯。
 
2、细胞核染色暗淡
原因：(1) 切片在苏木精染色液中停留时间太短；(2) 苏木精染色液过度氧化；(3) 分化步骤时间过长；(4) 骨组织脱钙过度。
对策：重新染色，若固定时间过长导致染色能力减弱，需延长苏木精染色液停留时间或采用增加组织嗜碱性的方法。
 
3、细胞核过染
原因：(1) 切片在苏木精染色液中停留时间过长；(2) 切片过厚；(3) 分化步骤时间过短。
对策：若非切片过厚导致，重新染色并适当调整染色和分化时间。若是切片过厚，需重新切片。
 
4、细胞核呈红、棕色改变
原因：苏木精染色液过度氧化或切片返蓝不足。
对策：检查苏木精染色液的染色能力，及时更换过度氧化的液体。在苏木精染色后，用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氢钠等进行足够的蓝化处理。
5、伊红着色淡
原因：（1）伊红染液的pH值可能大于5；（2）蓝化液残留过多；（3）切片太薄；（4）切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。
对策：检查伊红染液的pH值，如果必要的话，用乙酸将其调节在4～5之间，从而使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化步骤完成后，使用的弱碱性溶液被充分洗去，玻片上没有残留的弱碱性溶液。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长，因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。

6、细胞质过染
原因：（1）伊红染色液浓度太高，特别是焰红燃料、四溴四氯荧光素钠的存在；（2）切片在伊红染色时间过长；（3）切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。
对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样，也要检查切片的厚度是否合适。

7、切片中出现蓝黑色沉淀物
原因：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。
对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液，如Gill苏木精染色液,可以避免过多的金属膜产生。

8、显微镜下见切片内有大量水珠
原因：切片经梯度乙醇处理后没有脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。
对策：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇中，待切片重新脱水后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。

9、光镜下切片某些区域难以聚焦
原因：盖玻片上可能有封固切片的封固剂。
对策：移去盖玻片，重新用干净的盖玻片封片。

10、封固剂从盖玻片与载玻片之间的缝隙回缩
原因：（1）盖玻片弯曲或不平整；（2）封固剂含二甲苯过多，稀释过度。
对策：移去盖玻片，重新找一张盖玻片，用干净的封固剂封片。每天保证盛装封固剂的容器密封性良好，在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂，一旦封固剂太粘稠，就可以废弃不再使用。

11、切片从脱蜡的二甲苯经过梯度乙醇进入水溶液时，水和玻片呈现乳白色混浊改变
原因：用于脱蜡的二甲苯没有被乙醇洗干净。
对策：更换洗涤二甲苯的乙醇液体，把切片重新放回无水乙醇，脱去玻片上的水分。

12、细胞核灰蓝
原因：（1）组织处理温度过高、过热，在石蜡停留的时间过长；（2）固定时间太短，接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。
对策：理论上来说，加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用，组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理，完成浸蜡处理后的组织，可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中，冷却凝固，以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好，脱水最好能从低浓度的乙醇开始。

13、切片中出现类似色素样的点状结晶和黑色光滑的细胞核
原因：切片封片前放置在空气中时间太长，以至于二甲苯挥发切片干燥所致。
对策：移去组织切片上的盖玻片和封固剂，重新处理。将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。
 
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