基因定点突变技术

  体外定点突变技术是当前生物学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。

 
   蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
 
CRISPR-Cas9系统的靶向双链断裂（DSB），基因组通常通过非同源端连接（NHEJ）进行修复，通过插入和缺失诱导基因敲除（Indels）。基因敲入和精确突变的引入可以通过使用供体DNA模板的同源定向修复（HDR）来实现，但其效率通常很低，可通过增加抗性筛选来富集阳性克隆，但获得纯合克隆的概率极低。这阻碍了该技术在临床应用中的发展。但研究发现使用ssodn作为供体模板时，因为ssodn片段较短，同源定向修复（HDR）获得纯合的概率远高于DNA模板的同源定向修复。
 
常用的定点突变CRISPR-Cas9系统电转方法是将 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育结合为 RNP，加入ssodn一起电转到靶细胞中，进行单 sgRNA 切割。实现突变位点周围基因断裂。
 
如何快速高效构建自己的基因突变细胞株是很多人关心的问题，我们梳理了3个步骤帮你显著提高点突变实验成功率：
（1）切割位点到突变位点的距离；
（2）引入同义突变，防止Cas9-sgRNA的二次切割；
（3）通过优化距离提高纯合或者杂合的偏向性。
 
1. 切割位点到突变位点的距离
 
获得纯和点突变细胞株首要标准是切割位点到突变位点的距离，最好不要超过10bp,小于5bp为最佳。突变位点距离切割位点越近越好。
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因为定点突变HDR修复并不需要完整的同源臂作为修复模板，细胞可以仅使用同源臂的一部分用于HDR修复，这使得远离Cas9-sgRNA切割位点的突变，无法被有效整合进基因组。
 
研究发现，突变整合效率随着与突变位点到切割位点距离的增加而迅速下降。与切割位点距离10bp整合效率下降约一半，超过30bp则一般无法整合到基因组。
 
因此，我们通常建议突变位点与切割位点的距离不超过10bp，从而保证较高的整合效率。（这个也是Cas9X | 海星生物为什么建议细胞的点突变附近要有合适的gRNA序列）

 
2. 引入同义突变，防止Cas9-sgRNA的二次切割
同义突变是指：同义突变是DNA 片段中有时某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸。其原因在于该位置的密码子突变前后为简并密码子。点突变一般采用单链寡核苷酸（ssDNA）作为HDR模板，可以通过在PAM位点或者guide区域靠近PAM位点引入突变的方式，显著降低二次切割的概率。
 
 
如果点突变位点距离PAM位点较远（＞10bp），通常可以在PAM位点附近引入同义突变，防止二次切割。如果PAM位点或者guide区域不在编码区域上，无法引入同义突变，该PAM位点或者guide区域不影响外显子剪切对该基因无影响时可直接引入突变。否则可以通过两步法进行实验：第一步，先引入点突变和PAM位点突变，获得双突变的阳性克隆；第二步，将PAM位点突变回野生型，获得仅靶位点突变的阳性克隆。同义突变要选择突变成此转录本被广泛使用的氨基酸对应密码子，不要选择稀有密码子。
 
3. 通过优化距离提高纯合或者杂合的偏向性
有一些课题研究，如阿尔茨海默氏病的研究，是需要用到杂合突变的。而通过优化突变位点与切割位点的距离，可以帮助我们更有效地获得杂合或者纯合的突变克隆。

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