琼脂糖凝胶电泳实验步骤

(1)安装电泳管

选择聚含均匀、无气泡、无裂缝、胶面平整并与管壁没有脱离现象的合格凝胶电泳管 插入上电极槽底板的各圆孔中，留1/5在底板上方，保证使电泳管与底板垂直，密封处不 致渗漏。

(2) 加样

可利用上述方法制成样品胶，也可以用如下的一种方法加样。

将样品溶于200mg/ml浓度的蔗糖溶液中，或溶在10%甘油中，然后加在浓缩胶的 表面。

或将熔化的琼脂与样品溶液混合后加在浓缩胶表面。

或用与电泳管内径相近的圆形厚滤纸片，将样品溶液吸收后，紧贴在浓缩胶表面。 如样品是固体，应先溶在浓缩胶缓冲液中，并加入足够量lmol/L的蔗糖溶液，使样 品溶液的比重增大，再加在浓缩胶表面.

加样体积一般不超过100山常用虽为20〜50山 含量不超过100昭,常用量为20〜 5外拿如果样品是一个多组分的混合物，加样量可增加到200_Mgo如果样品是一种抽提液, 必须去除有形颗粒，取可溶部分上样。

必须保证样品溶液具有低电导性，盐浓度不应超过0. 05mol/L_o

目前常用的加样方法是：用稀释5-10倍的浓缩胶缓冲液，使其成lmg/ml的浓 度，再加蔗糖使成浓度，然后在浓缩胶面上有电极缓冲液存在的情况下，用合 适的加样工具如微堇注射器，插入浓缩胶面与上方的电极缓冲液界面处，轻轻地将样品加 在浓缩胶面上.

(3) 加电极缓冲液

样品加入后，在上下两个电极槽中灌注电极缓冲液，缓冲液的温度需与电泳温度一 致。加入缓冲液时应小心操作，不能搅动电泳管中的样品溶液，并不使电泳管上下口留有 气泡。缓冲液的用垃随容器的大小而有异。一般情况下电极槽中的缓冲液量能使电泳管 至少有3/5浸入缓冲液为宜。

(4) 加指示染料

对于诚性系统常用的指示染料为0. 001%漠酚蓝，酸性系统常用的是0. 005%甲基绿 或甲烯蓝。用量为每500ml缓冲液加指示染料1ml_D 一般加在上电极槽缓冲液中。

另有一种办法是将染料配制成0. 1%浓度的溶液，每管加5贝，与样品溶液混合后加 入。

(5) 电泳

装配好电极，接通直流电源。碱性系统上电极接负极，酸性系统上电极接正极。

对于直径5〜7mm的凝胶，最初2分钟用1mA/管的电流进行电泳，然后逐渐升高到 2〜5mA/管（10分钟）。通常5mm X 65mm的凝胶在20 C时用4mA/管进行电泳,大约需

时40分钟。

在电泳过程中，常要求电流保持恒定。此时，电压会有升高。如果电流大而产生过高 的欧姆热，影响某些样品时，可以降低电流而延长电泳时间。

可以看岀，由于水的电解在负极产生H2,在正极产生1/2 O2,同时,HA不断消耗。从 两个电极反应可以知道：为了保持缓冲液有几乎不变的缓冲能力，上下电极槽必须足够 大，以盛放足够量的缓冲液。

有时候，我们需要进行长时间的电泳。例如:DNA的分离有时长达10余小时。为了防 止由于电极反应使缓冲能力耗尽从而引起pH的变化影响分离，1977年美国匹兹堡大学 T.G. Cooper提出用循环缓冲液的办法来保持缓冲能力不致耗尽，以达到缓冲溶液能较 长期使用的目的。

Cooper的循环缓冲液方法示意见图2-3_o

上下两个电极槽的缓冲溶液水平保持恒定，但又没有建立通路。下槽的缓冲液可靠输 液器一滴一滴地滴入上槽。而当上槽的缓冲液增加时，就会经溢流管滴回到下槽，使上下 两槽的缓冲液水平在电泳过程中始终保持恒定。要注意的是,滴入上槽中的缓冲液，必须 不是线状连续的。

凝胶的取出

电泳结束取出电泳管。然后,用配有细长针头并盛有水的注射器，将针头小心地插入 凝胶和玻璃管壁之间，边插入转动管子同时压进一些水，另一端也作同样处理。然后，将管

F套上橡皮管用自来水压力压出凝胶，或用洗耳球压岀凝胶。如果压岀凝胶困难时，注射 器内可装甘油代替水压入凝胶和管壁之间。也可以用一根金属细丝，从凝胶和管壁之间穿 过整个玻璃管，然后，拉紧金属细丝转动玻璃管一周，就能使凝胶脱离管壁，再用洗耳球挤 压，就很容易压出。

也可以将电泳管浸入甲醇中，使凝胶收缩与管壁脱离而取岀，或根据具体条件用别的 办法取出凝胶。但必须注意，无论用何种办法，必须不损伤胶面。特别是浓度低的大孔凝 胶，宙「机械强度差，取岀时应格外小心。

凝胶的染色——分离区带的检出

(1)蛋白质的一般染色方法

固定和染色常可同时进行。因为，染料的溶剂一般就是固定剂.常用的几种染色方法 简述如下：

(i) 氯基黑10B (amido black 10B)用7%的醋酸配制0. 5%〜1%的染料溶液，浸 染2〜6小时，染色后用水洗。

用7%的醋酸配制1%的染料溶液,96 C保温染色10分钟，可以改善对弱区带的分辨 率。

(ii) 考马斯亮蓝 R-250 (Coomassie brilliant blue R-250)先用 12. 5%三氯醋酸固 定数小时，出现白色沉淀条纹后，在三氯醋酸中滴加少量1 %考马斯亮蓝R-250溶液，过 夜，用此法染色底色很浅，通常染色后不需脱色。

或用0. 25%考马斯亮蓝R-25O的甲醇-醋酸混合液(454ml 50%的甲醇+ 46ml冰醋 酸)染色2-10小时。

或先用20%磺基水杨酸固定18小时，然后用0. 25%考马斯亮蓝R-25O的无重金属 离子的水溶液染色0. 5〜2小时。或用0. 25%考马斯亮蓝R-250的9%醋酸和45%甲醇 混合液染色0. 5-2小时。

(iii) 考马斯亮蓝G-250先在5%三氯醋酸中固定30分钟，水洗几次，然后用1% 该染料的7%醋酸溶液，染色10分钟。或用0.1%该染料的甲醇:水：醋酸(10 ： 10 ： 1 v/v)混合液，染色30分钟。

(iv) 固绿(fast green)用1%固绿的7%醋酸溶液，染色2小时。最好在10C以下进 行₀

(v) 普施安亮蓝RS (Procion brillant blue RS)先在20%磺基水扬酸固定0. 5〜2 小时，然后用1%该染料的10%醋酸和50%甲醇混合液染色1〜2小时。

(vi) 1%考马斯亮蓝R-250溶剂是水：甲醇：冰醋酸(5 : 5 ： 2),使用前用滤纸 过滤去除不溶物。柱状凝胶条室温染色至少4小时。1.5mm厚的平板凝胶，室温染色4〜 6小时。

(vii) 硫酸铜-考马斯亮蓝混合染色液10g硫酸铜定溶于800ml蒸偕水中，再加入 200ml醋酸作为染色贮备液A。

3g考马斯亮蓝G-25O溶于900ml甲醇中，再加蒸馋水至1 000ml作为染色贮备液B。 使用前等体积搅拌混合贮备液A和染色30分钟至数小时视不同样品而异。

更多电泳相关设备进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司进行了解咨询。