SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用试剂及设备

试剂：蛋白值样品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸，5×SDS-PAGE电泳缓冲液，考马斯亮蓝R-250染色液，脱色液、天能预制胶。

仪器耗材：垂直电泳槽，电泳仪，电泳仪电源，移液枪，移液枪tip吸头，离心管、试剂瓶。

实验步骤

一、凝胶配置

1．分离胶的配制

（1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。随后用去离子水试漏；

（2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中，混匀（1mm的胶板，一般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%，但浓度也要视情况而定。蛋白越小，胶的浓度越大）；

（3）将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分（不要将滤纸塞到胶板底部）；

（4）小烧杯中再加入TEMED，混匀。（TEMED可使胶凝固，所以最后加）；

（5）灌胶：混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡；

（6）用水将分离胶压平（用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起）。

也可以直接使用预制胶，预制胶直接拆开即用，不用配制。

2．浓缩胶的配制

（1）待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制，依次将水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中；

（2）将分离胶上层的水倒掉，并用滤纸吸干水分（尽量不要把滤纸插入）；

（3）小烧杯中再加入TEMED，混匀；

（4）灌胶。然后插入梳子；

（5）把制胶器倒过来，胶仍然不会往外流，或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去，说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内，并在电泳槽内加入SDS-PAGE电泳缓冲液，把胶浸泡一段时间，时间越长越好（防止梳子与胶相连，或胶因湿度不够而缩减）；

（6）点样时，再把梳子拔出来，拔时动作要轻，防止胶齿被拔断。

二、SDS-PAGE电泳步骤

1、调胶：拔掉SDS胶上的梳子，并用小针调整齿的位置（使它们都平行）。

2、点样：用20µL的小枪头，吸煮过的样品10µL，对准胶孔点样，注意不要把样品点在外面。使用适当的分子量蛋白marker。

3、电泳：电泳仪正负极接好，打开电源。浓缩胶：电压 low 100V，分离胶：电压 high 150V。

4、卸胶：等胶内的所有的蓝色都跑出去，电泳停止，一般时间为1-2小时左右。把胶板从电泳仪上卸下，用刀片把胶板撬开，胶的浓缩胶部分割除；

5、染色：放入考马斯亮蓝R-250染色液中进行常温过夜染色；

5、脱色：将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色，直到背景发白。

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