流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法

   流式细胞仪是一种用于细胞分析的实验室仪器，它能够对单个细胞进行快速而精确的定量和质量分析。它主要通过将细胞悬浮液注入到仪器中，利用激光器照射细胞并检测经过细胞的光线散射和荧光信号，从而获取大量有关细胞形态、大小、复杂度、表面标记以及内部分子的信息。它可同时测量多个参数，并具备高通量性能，能够快速分析数以万计的细胞，并提供详细的统计学数据。它广泛应用于免疫学、细胞生物学、药理学、肿瘤学等领域的研究和实验中。

    然而，在分析流式细胞仪得到的荧光结果时，常常会遇到一些问题，如信号强度弱、背景高、细胞群分布异常等。本文将介绍常见问题，并提供相应的解决方法。

一、信号强度弱

1. 信号补偿不正确：检查流式细胞仪上的单色阳性对照是否设置正确，并确保门控和补偿设置正确。

2. 用于检测的抗体不足：增加抗体的量或浓度。

二、荧光强度高

1. 抗体浓度过高：减少每个样本中添加的抗体量。

2. 过量抗体被捕获：洗涤步骤要充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton，以保持细胞的透化作用。

3. 封闭不足：在抗体混合液中加入1%-3%的封闭剂，并增加封闭步骤。

三、背景高/阳性细胞百分比高

1. 增益设置过高/补偿过低：使用阳性对照正确设置流式细胞仪，并使用补偿减少小颗粒背景信号和降低增益。

2. 抗体过量：降低抗体的浓度，并在洗涤缓冲液中加入去污剂，确保洗去过量的抗体。

四、在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群

1. 表达靶蛋白的细胞群不止一个：检查样本中包含的细胞类型预期的蛋白表达水平，并确保细胞充分分离。

2. 出现细胞双峰：细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。在染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，并在细胞仪中运行之前再次混匀。

五、侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

1. 细胞裂解：确保样本中的细胞没有裂解和破碎，样本应新鲜并正确制备，避免高速离心或激烈涡旋的操作。

2. 细菌污染：确保样本不受细菌污染，细菌会自动发出较弱的荧光，导致高事件率。

六、低事件率

1. 每毫升的细胞数过少：将细胞稀释至1×105至1×106个细胞/mL，确保细胞均匀混合。

2. 细胞聚集阻塞管道：在染色前轻柔吹打几次，确保得到同源单细胞悬液，也可以筛选或过滤细胞，去除团块。

七、高事件率

1. 细胞数量过多：稀释样本至1×105至1×106个细胞/mL。

   通过以上问题及解决方法，我们可以更好地分析流式细胞仪得到的荧光结果。然而，需要注意的是，不同实验条件可能会导致不同的问题和解决方法。因此，根据实际情况，选择合适的解决方案是很重要的。同时，定期检查和维护流式细胞仪，以确保其正常运行，也是避免问题发生的重要措施。     

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