脐带间充质干细胞分离实验

 脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。 HyCyte®脐带间充质干细胞取自满月自然分娩的胎儿脐带，传代扩增至第二代冻存。本产品经生物安全检测，无细菌、真菌、霉菌、支原体和病毒污染，表达多种人源间质干细胞特异性标记，具有良好的增殖和分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。

一、实验目的

  验证HyCyte®人脐带间充质干细胞培养基对于人脐带华通质胶中提取间质干细胞培养的能力。人体脐带横截面示意图，脐带内层覆盖，外层为脐上皮，三个脐血管嵌在华通质胶中。华通质胶是一种凝胶状结缔组织，由富含糖胺聚糖（主要是透明质酸）、胶原纤维和肌成纤维细胞以及偶尔存在的肥大细胞的细胞外基质组成。华通质胶基质细胞在血管周围附近最为丰富，在血管间华通质胶中变少。

二、实验试剂和实验耗材

试剂：人脐带间充质干细胞培养基（Cat.No.: UCHX-G101）

间充质干细胞 其他配套试剂均为HyCyte

耗材：T175培养瓶

三、实验步骤

(1)用无菌辅料镊从转运瓶中取出脐带，置于1×PBS培养皿中。

(2)清洗脐带，转移至另一1×PBS培养皿中，重复 3次。

(3)将脐带剪成4 cm左右小段，再清洗3次。

(4)去脐带血管、羊膜，取华通胶。

(5)华通胶转移至1个50 ml离心管中，剪碎至糜状。

(6)T175瓶中加入40 ml人脐带干细胞培养基。

(7)按每个T175瓶1 ml组织接种。混匀，静置培养。

(8)静置培养5 d以上，观察贴壁克隆少，继续培养。

(9)培养7 d后，观察贴壁克隆多，加培养基培养。

(10)培养9 d后，克隆已有较大规模增殖，继续培养。

(11)培养第10天，按1:1传代于新 T175瓶。同时，组织转移至新T175瓶进行二次迁移。

实验总结

   本次实验历时18天，成功分离培养人脐带间质干细胞。脐带组织块贴壁正常（通常脐带组织贴壁形成克隆时间在5-10天）。观察到贴壁细胞形态为长梭状，边缘明亮。在传代中，P1 代细胞形态正常，密度均匀。此后传代3次，无老化现象。汇合度较高时，细胞呈明显漩涡状极性。本产品可正常提取、培养 脐带间质干细胞 。