重组克隆的筛选与鉴定

重组克隆的筛选与鉴定

一、实验目的

通过筛选，获得含目的片段的重组克隆。掌握利用酶切或PCR方法进行阳性克隆的筛选与鉴定步骤。

二、实验原理

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 

由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)，可通过Amp抗性来筛选转化子。受体细胞没有转入pUC，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行酶切或PCR等进一步鉴定。                   

三、主要试剂

胰蛋白胨、酵母粉、琼脂、Amp、IPTG、X-Gal

四、仪器耗材

超净工作台、培养箱、平皿、移液器、tip。

五、实验步骤   

1. 记录样品的转化子总数，白色和蓝色菌落各有多少。

2. 记录对照2的菌落数，计算阳性对照的转化频率。

3. 挑取一个白色菌落，接于2mL的LB中

4. 37℃培养过夜。

5. 快速碱裂解法抽提质粒，具体方法参见同实验二。

6. 酶切，同时以提取的质粒作对照，具体方法参见实验三。

取2μL质粒进行双酶切，酶切体系如下：10×bf 2μL，限制酶各0.5μL，H₂O 15μL。37度，2-4hr。0.8-1%琼脂糖电泳检测。

    7. 或者使用PCR鉴定阳性克隆，具体方法参见实验一。

六、注意事项

1. IPTG和X-Gal在培养基上一定要涂匀。

2. 平板如在培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 

思考题：

1. 如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动，你认为可能是什么原因？

2. 请分析实验结果出现假阳性的具体原因。

3. 实验结果与分析：如果电泳后（1）只有载体条带，看不到插入片段的条带？（2）出现2条以上的条带？如何解释。

4. 本实验的目的是克隆基因Xbc，为基因表达做准备。你认为经过酶切鉴定是否获得了Xbc的阳性克隆？为什么？并写出后续的实验步骤或计划。

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