使用PCR仪进行基因扩增的实验方法

实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaqTM ， EXTaqTM  和  Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶， 保真性较差 ， 但价钱便宜， 一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading  活性的耐热性 DNA 聚合酶， 具有一定的保真性， 而且其扩增得到的 PCR 产物 3 ’ 端附有一个 “A" 碱基 ，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶， 其特点是保真性高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1.   按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液：

TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方

merase 的配方

① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µl 以节约试剂；

② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；

③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50µl  的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；

2.   按以下程序进行 PCR 扩增。

PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异， 在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。

反应结束后，抽取扩增样品 5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

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