大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切PCR 扩增。

1.   取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中， 4000rpm  离心 1 分钟， 弃上清液， 使细菌沉 淀尽量干燥；

2.   将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖， 10 mmol/L EDTA pH 8.0 ，25 mmol/LTris-HCl pH 8.0)  中，剧烈振荡；

3.   加入 200 μl 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH ，1％SDS（m/v）)，盖紧 EP 管 口，快速颠倒离心管 5 次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.   加入 150 μl 预冷溶液 III(每 100 ml  的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L   乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)，盖紧 EP 管口，反复颠倒数次，使溶液 III 在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5 分钟；

5.   在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 EP 管；

6.   用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA，振荡混合于室温放置 2 分钟， 最大转 速离心 5 分钟；

7.   小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.   加 1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用 12,000g 离心 2 分钟，弃上清，将 开口的 EP 管置于室温使乙醇挥发， 直至 EP 管中内没有可见的液体存在（5 ~ 10 分钟），用适量的 ddH2O 溶解；

9.   用 0.5μl 的 RNase 37℃温育 5~10 分钟；

10. 电泳鉴定。

乙醇沉淀DNA

1.    加入 1/10 体积的乙酸钠（3mol⁄L，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混匀， 使其 最终浓度为 0.3 mol⁄L；

2.    加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中 15~30 分钟；

3.    12,000 g 离心 10 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.    加入 1/2  离心管容量的 70％乙醇， 12000g  离心 2 分钟， 小心移出上清液， 吸 去管壁上所有的液滴；

5.    于室温下将开盖的 EP 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；

6.    加适量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。

酶  切

1.   酶切前确定待切样品的浓度,  并选择合适的限制性内切酶和配套 Buffer。 2.   在离心管中加入如下成分：

10 ×Buffer     1μl

待切样品  xμl

酶        0.5-1μl

加水补足 10μl

3.   混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.   将离心管置于 37℃中温育 1-3hr，若待切样品为 PCR 产物， 则可将反应时间 适当延长。

5.   用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。

注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的 Buffer 或者通用 Buffer，但要注意不能有星反应。）

连 接

1.   连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。

2.   在离心管中加入如下成分：

10 ×连接 Buffer 1μl

待连接的样品（胶回收产物或 PCR 产物，载体与片段的 mol 比为 1∶3-5）

连接酶 0.5-1μl                                                                            

加水补足 10μl

3.   混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

4.   将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求

而定， 一般为 22℃ 1-3hr 或 16℃连接过夜）。

连接完的样品可直接用于转化，也可放 4℃冰箱短期保存。