细胞培养前的灭菌处理技术

    无论从事何种细胞培养，无菌技术都是绝对最重要的部分。细胞培养前的无菌处理技术分为三部分即：①工作环境及表面的处理；②细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理；③实验者的操作技术；还有哺乳动物细胞的处理及维持细胞生长所需要的培养液的无菌处理。

1.工作环境的无菌处理

在细胞培养早期，研究者可以依靠操作技术和尽可能地靠近火焰以达到细胞的无菌化，随着工作环境的机械学发展，其无菌化程度已得到大大提高，免去了实验者手指被烧灼的痛苦。层流超净台是使工作台无菌化有效的手段，组织培养可在相对密闭而几乎无对工作面外界气流干扰的区域内进行。更周密(但较吊贵)的用于隔离无菌场所的设备就和用于手术间的设备相似，通过该场所的空气均经过HEPA过滤层后循环使用，通过出口处的气流形式为向下和向外的。超净台的使用允许研究者将实验 室的一角转变为组织培养区域，这种工作台甚至在空气经过HEPA过滤的房间中也有其便利之处。空气源污染主要是由于气流和烟雾进入培养瓶或培养液污染所致，实际上保持无菌间足够清洁而无污染物的堆积不太可能，而超净台即可提供容易清洁并可保持的良好工作台。此外，超净台在研究者坐方对面的开放的前部形成一种向下的气流屏障。

   超净台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。超净台HEPA过滤层应在每年或一年后由被认可的机构进行维修。购买超净台时应一同购买内部电源、真空泵和气体的内部出口。在某些情况下，研究者可在超净台中安装空气喷射装置；超净台通常装有紫外灯。水平气流的超净台不宜使用，因为气流直接吹向研究者，而可能导致操作者无率的受到可能来白实验器材上的病原菌污染。同样道理，从工作台吹出的气流在吹到周围环境前也应先通过隔离的HEPA过滤层蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。工作台内只限放置每日工作所必湍的物品，其他非必需物应去除。日常的清洁工作包括用70%乙醇或10%新洁尔灭擦洗工作台，用一个连接到真空泵的密闭容器作为装废弃液的容器。该容器应随操作内容改变后进行高压处理后再放入超净台内：加入20ml新洁尔灭有助干防止微生物在其中的滋生繁殖，减少废液的污染度、不要使用开放的烧杯或容器装废液，也不宜采用倾倒操作丢弁、废弃的培养液，因为这操作都可导致废液的气雾化，从而能导致微小尘粒再次进入细胞培养瓶中。

2.玻璃器具和塑料制品的无菌处理

  一次性用品。细胞培养瓶或培养皿经适当处理后使细胞更易附着，通常单层细胞培养物在塑料瓶比玻璃瓶中更易附着、生长更快。塑料瓶本身无活性，更适宜在4℃储存溶液；而冻存管则宜使用玻璃制品，因为其可耐受0℃以下低温。

  尽管塑料吸管、瓶子比起玻璃器材有其优点，但其价格昂贵.因为玻璃制品可反复使用。但处理玻璃器材设备有限或没有的实验室，选择塑料制品更为合适。

   利用高压灭菌器进行组织培养器材的蒸气灭菌是常用的灭菌方法。玻璃器材应采用高压灭菌后快速风干法蒸发冷凝气。瓶盖应松松地盖在瓶口上进行高压灭菌，瓶子的消毒也可采取瓶口铝箔包裹，瓶盖单独消毒的方法，待冷却至室温后在超净台中再盖在瓶口上。玻璃吸管应塞上棉花后再进行灭菌，然后置烤箱中烘干以免棉塞残留水份，应遵照高压灭菌器材生产厂家推荐的有效的高压灭菌方法进行操作。高压灭菌法的效果取决于其蒸汽压力和高热状态。许多溶液(如Tris缓冲液，细胞培养液)不应采用高压灭菌法进行消毒，而用于微生物培养的培养液及多种盐溶液宜采用“缓慢耗竭"及“湿 气"循环法以防液体蒸发。不宜进行高压灭菌的瓶塞和其他用品可浸泡在70%乙醇中进行消毒，并在超净工作台上吹干。

3.无菌操作

  无菌操作的原则就是保证细胞培养皿、培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。细胞培养需要比外科手术更加严格的无菌操作，因为离体细胞没有免疫防御系统有几种操作规程有助于无菌技术的掌握。细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行；培养用液或其他溶液不应在工作区以外打开，装吸管的铁筒同样如此勿使用先前已打开的吸管简里的吸管。一旦筒盖打开，尽量将筒内吸管用完，如当天尚未用完，应从超净工作台内取出，补充洗净的吸管，然后重新进行灭菌处理后备用。超净台在实验完毕后应腾空，并用适当的消毒液擦洗桌面。

   对细胞培养者来说，一次性乳胶手套的使用被视为一种安全的象征。但切记手套本身并不需要无菌。细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置。采用口吸是最大的微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入方式进入入体，可能对研究人员造成危害。

   细胞培养中用的各种瓶子仅在超净工作台中打开，瓶盖应盖顶朝下放置于工作台上，勿将瓶盖放在非无茵工作区，如果瓶盖的边缘已污染，就可能通过与瓶口的接触而污染瓶中的培养液或吸管、废弃吸管、细胞培养瓶等应放入可封装的容器中，对可能含有潜在的生物有害物质的物品应采用焚烧和/或高压火菌法进行处理，这是一种大家广为采用的安全措施。

    湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提供培养箱合适的度，而托盘本身即可导致各种细菌和真菌的污染，这种污染还存在于培养箱壁上和提供气体的管道上。这些培养箱应定期在细胞移至其他培养箱后进行加热处理(如果有加热程序的话),或采用70%乙醇擦洗表面，并定期更换输送C02的管 道。该管子可置于20%的含氯漂白剂中浸泡以达到消毒目的。采用高热于燥法是一种相当有效的消除细菌、真菌甚至真菌孢子的方法。C02培养箱中托盘始终用饱和浓度的磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体达到盘中的高盐浓度，既使得细菌不能在其中生长，而又能提供合适的湿度.每周均应 补充无菌双蒸水，而Na2HPO4应在无固体盐出现时加入。

   为了防止细胞系的交叉污染，超净台中应只进行一种细胞系的操作。较理想的方式是每种细胞系使用两瓶各自单独的培养液，以免一旦出现污染导致全部细胞的污染。这点对进行克隆的衍生株或尚未冻存的新建立的细胞系特别重要。超净工作台中应尽可能不放置任何设备和器材，以避免由于偶然接触有菌物品导致的污染。在层流超净台中，允许培养液瓶口敞开，因为空气是经过过滤后进入工作台的，所以进入开口的瓶内的空气是过滤的空气。但是提倡在培养液不使用时将瓶口盖紧，以免因为偶尔碰到瓶口或拿放非无菌物品通过开放的瓶颈时使衣袖上或其他非无菌物品的细菌掉落到培养液中。培养箱中的细胞应经常置显微镜下观察，每周至少两次，以确定细胞的生长状态或有无明显的污染存在。不再需要的细胞应该 立即丢弃，而不是继续留在CO2培养箱中。

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