蛋白质保存全知道：稳定蛋白质活性的科学指南
蛋白质在生物体内扮演着极为重要的角色，它们参与细胞的构建、催化化学反应、传递信号等多种生理过程。在实验室研究、生物技术应用以及生物制药等领域，蛋白质也是关键的研究对象和生产原料。然而，蛋白质在制备、保存和使用过程中却面临着诸多挑战，如容易出现聚集、沉淀和变性等问题，这些问题会严重影响蛋白质的活性与功能，进而影响相关研究和应用的准确性与有效性。
一、影响蛋白质稳定性的因素
（一）剧烈刺激
蛋白质对环境变化较为敏感，pH 值的大幅波动、温度的急剧升降、反复冻融循环、搅拌以及过滤等操作都可能成为破坏蛋白质稳定性的 “元凶"。搅拌会使蛋白质暴露于空气 - 水界面，过滤则让其处于液体 - 固体界面，而 pH 值与温度的剧烈变化更是直接干扰蛋白质分子内部的化学键，这些因素综合起来极有可能导致蛋白质空间结构发生改变，使其原本有序的结构变得松散无序，最终形成沉淀而失去活性。
（二）氨基酸侧链变化
蛋白质中的某些氨基酸侧链容易发生化学反应，进而影响蛋白质的整体稳定性。像甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸等氨基酸残基具有较高的氧化敏感性，一旦被氧化，蛋白质的结构和功能便会受到损害。此外，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺作用以及肽主链肽基团的切割也较为常见，这些变化会改变蛋白质的化学组成和结构，最终导致蛋白质功能的改变甚至丧失。
二、蛋白质的保存原则
（一）减少蛋白酶影响
蛋白酶犹如一把 “剪刀"，能够催化蛋白质和多肽的水解反应，将它们切割成更小的片段。由于蛋白酶广泛存在于各种环境中，在蛋白质制备的初始阶段就必须考虑如何降低其对目标蛋白质的破坏作用。可以选用蛋白酶缺陷的菌株来生产蛋白质，从源头上减少蛋白酶的含量；在破菌纯化蛋白的第一步就及时加入蛋白酶抑制剂，抑制胞内蛋白酶的活性；同时，使用经过严格灭菌处理且无杂质污染的枪头、缓冲液等耗材，避免其他微生物来源的蛋白酶混入样品中。值得一提的是，如果目的蛋白以包涵体形式存在，由于其特殊的结构，能够在一定程度上抵御蛋白酶的攻击，降低被破坏的风险。
（二）低温保存
低温环境对于蛋白质来说就像是一个 “保护罩"。低温能够显著降低蛋白质分子的热运动，减少分子内部化学键断裂的可能性。同时，低温还能抑制微生物的生长繁殖，降低蛋白酶的活性，从而为蛋白质的保存创造有利条件。对于短期保存（1 周以内），通常将蛋白质置于 4°C 的环境中较为适宜；而对于长期保存（数月至数年），则需要更低的温度，如 -20°C 或 -80°C。不过需要注意的是，-20°C 冰箱在实际使用过程中，由于频繁开关门，尤其是靠近冰箱门的区域，温度波动较大，很难稳定维持在 -20°C，甚至在无霜冰箱中还可能出现反复冻融现象，这对蛋白质的稳定性极为不利。此外，-20°C 接近某些盐的共融点，容易导致晶体反复冻融，进而引发蛋白质变性。因此，在条件允许的情况下，-80°C 是更为理想的长期保存温度选择。
（三）分装保存
蛋白质在冷冻保存与使用过程中存在一个棘手的问题，那就是反复冻融。每次冻融都会对蛋白质的结构造成一定程度的损伤，导致其活性逐渐丧失或发生变性。为了减少这种损伤，将纯化后的蛋白质进行分装保存是一种有效的策略。一般建议每管分装 50 至 100 微升，具体可根据蛋白质的浓度以及实验的实际需求进行适当调整，但每管最少不应低于 10 微升。在使用时，仅解冻本次实验所需的部分，并且尽量控制冻融次数不超过两次。对于实验剩余的蛋白质，如果短期内还会使用，可暂时存放在 4°C 冰箱中，但存放时间不宜超过一周。
（四）控制浓度
蛋白质的浓度过高或过低都会引发一系列问题。当浓度过高时，蛋白质分子之间的相互作用增强，容易发生聚集并沉淀下来；而当浓度过低（低于 0.1mg/mL）时，蛋白质又会特异性地吸附在管壁上，造成蛋白质的损失，从而影响后续实验的准确性和可重复性。因此，在保存蛋白质时，需要将其浓度控制在一个合适的范围内，一般建议浓度为 1 - 10mg/mL。
（五）速冻与速融
缓慢的冷冻过程会使蛋白质处于一种极为 “恶劣" 的环境中，可能会使其暴露在高盐浓度高 pH 条件下，这种环境会严重破坏蛋白质的活性。因此，在冷冻蛋白质时，应采用快速冷冻的方法，如使用液氮或干冰 / 乙醇 / 丙酮混合物进行速冻，让蛋白质能够迅速越过危险的温度区间，减少损伤。同样，在解冻时也需要让蛋白质快速恢复到适宜的盐浓度和 pH 条件下，例如可以像复苏细胞一样，将蛋白质样品置于 37°C 的温水中快速解冻。
（六）合理使用添加剂
在蛋白质保存过程中，添加剂的使用需要谨慎选择，必须确保所添加的试剂不会对蛋白质的活性产生负面影响。
缓冲液：缓冲液能够维持溶液的 pH 值稳定，一般选择 pH 在中性范围内（如 50 mmol/L pH8.0 的 Tris - HCl 或 PBS），盐浓度在 0 - 150mmol/L 的缓冲液较为合适。合适的缓冲液可以为蛋白质提供一个相对稳定的化学环境，减少 pH 值波动对蛋白质稳定性的影响。
保护剂：不同的保护剂具有不同的功能。甘油（浓度为 10% - 50%）可以防止蛋白质在冷冻过程中受到损伤，避免因冻融而导致的变性；Na2N2（浓度为 0.02% - 0.1%）能够有效抑制细菌的生长繁殖，但需要注意的是，Na2N2会干扰某些抗体蛋白参与的氨基反应，在这种情况下，可以使用 0.01% 的硫柳汞来替代；PMSF 作为一种蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶对蛋白质的降解作用；DTT 则是一种还原剂，能够防止蛋白质发生氧化反应。然而，在体内实验时，由于Na2N2和硫柳汞可能对生物体产生毒性，因此不可添加这两种物质，通常采用过滤除菌的方法来保证蛋白质溶液的无菌性。
三、蛋白质的保存策略
（一）液体状态下不冻结保存
在液体状态下短期保存蛋白质时，可以将温度控制在 2 - 8°C，在这个温度区间内，蛋白质能够保持相对稳定，减少聚集沉淀的发生，但需要注意的是，即使在这个温度下，蛋白质仍然会发生缓慢的化学降解反应。为了进一步提高蛋白质的稳定性，需要调节溶液的 pH 值，使其维持在 5.5 - 7.5 的稳定范围内。此外，由于蛋白质具有较强的去折叠倾向，可以添加一些非特异性稳定剂，如 0.5M 的蔗糖，它能够与蛋白质分子相互作用，增加蛋白质的稳定性。还可以添加硫酸铵、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖等添加剂，这些添加剂通过优先排阻的方法维持蛋白质的热力学稳定性，其中柠檬酸盐缓冲液（在不存在钙离子的情况下）效果较为显著。溶液中离子的电荷屏蔽作用能够降低蛋白质分子间的电荷 - 电荷排斥作用，但离子浓度的选择需要根据具体的实验进行优化调整。
（二）冻结温度下保存
在选择冻结温度保存蛋白质时，-80°C 相较于 -20°C 具有明显优势。-80°C 能够更大程度地降低蛋白质的降解速率，为蛋白质提供更好的长期保存条件。而 -20°C 冰箱由于其自身特点，如频繁开关门导致温度不稳定，特别是在无霜冰箱中易出现反复冻融现象，且接近某些盐的共融点，容易造成晶体反复冻融，从而引起蛋白质变性。在缓冲液的选择上，由于低温下碱性盐容易结晶，酸性盐仍可溶解，冷冻时磷酸盐缓冲液 pH 值会大幅下降，这可能导致许多蛋白质发生变性。因此，应优先选择柠檬酸盐、Tris、组氨酸等缓冲液，以减少 pH 值变化对蛋白质的影响。同时，加入甘油、盐析盐、二糖（浓度高于 0.3M）、表面活性剂（浓度低至 0.1%）等保护剂，能够有效防止蛋白质在冷冻过程中发生变性和沉淀；添加百分之几的 BSA 或聚合物也可以抑制冷冻引起的蛋白质去折叠；适当增加蛋白质的起始浓度，能够增强其在冻融过程中对损伤的耐受性。
（三）冻干保存
冻干是一种较为特殊且有效的蛋白质保存方法，它通过将溶剂或悬浮介质在低温下冷冻，然后使固态的溶剂直接升华为气态，从而去除水分，得到干燥的蛋白质样品。这种方法能够很好地保持蛋白质物质骨架的稳定性，并且在复融后其结构和功能基本不发生改变。冻干过程主要包括预冻结、升华干燥和解析干燥三个阶段。在冻干过程中，添加必要的稳定剂对于防止蛋白质变性至关重要，其中非还原型的海藻糖和蔗糖（浓度为 200 - 300mM）作为稳定剂对蛋白质的保护较好。需要注意的是，应避免使用还原型糖，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖等，因为它们会引发美拉德（Maillard）反应，导致蛋白质降解。目前，商业化的蛋白质冻干产品通常采用添加海藻糖 5%、甘露醇 5%、tween - 80 0.01% 的方法来保护蛋白质。然而，冻干方法也存在一些不足之处，例如冻干设备复杂且昂贵，这使得冻干成本较高；某些蛋白质在冻干后可能无法全复溶，或者在冻干 / 复溶过程中会受到损伤，导致蛋白质活性下降。因此，冻干通常作为蛋白质保存的最后选择，只有在其他保存方法无法满足需求时才考虑使用。
四、蛋白质保存的注意事项
（一）SDS - PAGE 检测
在蛋白质保存过程中，如果发现蛋白质活性有所下降或丢失，首先应进行 SDS - PAGE 跑胶检测。SDS - PAGE 是一种常用的蛋白质分析技术，它能够根据蛋白质分子的大小将其分离，通过跑胶结果可以直观地观察蛋白质是否发生了降解，从而帮助我们初步判断蛋白质活性丢失的原因，为后续采取相应的措施提供依据。
（二）无菌操作
我们的皮肤表面存在着各种蛋白酶以及其他化学物质，这些物质很容易污染蛋白质样品，进而影响蛋白质的稳定性和活性。因此，在进行蛋白质相关操作时，务必戴上手套，避免皮肤直接接触蛋白质溶液；同时，使用经过灭菌处理的小管来保存蛋白质，防止微生物污染，确保蛋白质处于一个无菌的环境中。
（三）避免震荡
震荡过程中产生的剪切力以及气泡中的氧气会对蛋白质造成双重伤害。剪切力可能破坏蛋白质的分子结构，而氧气则容易引发蛋白质的氧化反应，导致蛋白质的活性丧失。因此，在蛋白质的制备、保存和使用过程中，应尽量避免剧烈震荡，保持操作的平稳性。
蛋白质的稳定性对于众多生物学研究和生物工程应用具有举足轻重的意义。了解影响蛋白质稳定性的各种因素，并遵循科学合理的保存原则、策略以及注意事项，能够帮助我们有效地保持蛋白质的理化性质稳定，延长其保存时间，确保蛋白质在研究和应用中发挥其应有的作用。
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