组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法

组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法 Ni IDA Beads填料

      Ni IDA Beads可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。它是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni2+）后，可以形成比较稳定的平面四边形结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果。但是，这样的结构比较容易受到其他小分子的进攻，镍离子易被还原或者被螯合，从而破坏其化学结构，无法结合目的蛋白。Ni IDA Beads具有载量高，性能和价值匹配等优点。

表1. Ni IDA Beads产品性能

2.纯化流程

2.1 缓冲液的准备

可使用下列推荐缓冲液，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱。缓冲液在使用前尽量用0.22 μm 或者0.45 μm 滤膜过滤除菌。具体配置方法见表2。

组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法 Ni IDA Beads填料纯化蛋白流程：

2.2.1 细菌或酵母表达的蛋白

1）挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2）表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7，000 rpm（7，500×g），离心15min 收集菌体，然后按照菌体∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer，加入终浓度为 1mM的 PMSF。加入溶菌酶（工作浓度为 0.2-0.4 mg/ml，如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合）。

3）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4）将澄清的破碎液转移至离心管中，10，000 rpm（15，000×g），4℃离心 20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1）将细胞培养液转移至离心杯，5.000 rpm（3.800×g）;离心10min，收集菌体得上清，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2）对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，蛋白还需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的装填

1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2）将 Ni IDA Beads 混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。

3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4-30℃保存。

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